基因工程-第四章-目的基因的分离及合成.pptVIP

第四章 目的基因的分离与合成;第四章 目的基因的分离与合成;第四章 目的基因的分离与合成;第一节 限制酶直接分离;鸟枪法克隆目的基因的基本战略;鸟枪法操作的改进;鸟枪法操作的改进;鸟枪法克隆目的基因的局限性;基因文库的基本概念;基因文库构建的基本战略;基因文库的完备性;基因文库的基本概念;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;基因文库的构建程序;第二节 建立基因组文库;第二节 建立基因组文库;第二节 建立基因组文库;第三节 cDNA基因文库的构建;第三节 cDNA基因文库的构建;二、cDNA基因文库的构建;二、cDNA基因文库的构建;二、cDNA基因文库的构建;二、cDNA基因文库的构建;二、cDNA基因文库的构建;二、cDNA基因文库的构建;二、cDNA基因文库的构建;cDNA法克隆目的基因的局限性;三、PCR扩增法;四、基因的化学合成;四、基因的化学合成;化学合成法的基本战略;;;;目的基因的分离;目的基因的分离;目的基因的分离;实例：基因组文库DNA → 转化酿酒酵母细胞（leu2,Leu-）→ 转化细胞（leu2/LEU2，Leu+）→LEU2基因 基因组文库DNA →转化E.coli（无纤维素酶活性）→ 转化细胞可在纤维素平板上形成水解圈 →纤维素酶基因 优点：简便，快速，可靠，是首选方法。获得的基因一定是完整基因。 缺点：适用范围较窄。 必备条件：外源基因不仅能在受体细胞表达，而且必须具备生物学活性。;1. 遗传互补法 1)??原理 当把一外源DNA片段引入一受体细胞后，如果受体细胞获得某种新的性状，那么此片段上携带着决定新性状的遗传基因。 i. 营养缺陷型受体细胞+外源DNA → 转化细胞涂布在合成培养基上 → 原养型细胞生长 ii. 受体细胞（无某种表型）+ 外源DNA → 转化细胞涂布在特殊培养基上 → 具有新性状细胞 iii. 虽然有些受体细胞也能产生某种酶活性，但当转入目的基因后，该细胞可过量产生此酶活性，这亦可用于基因筛选。如酿酒酵母的MFα基因就是如此筛选到的。;2) 分离步骤 分离基因组文库重组DNA分子 → 转化适当宿主细胞 → 涂布在选择培养基上→随机挑选阳性克隆，分离重组DNA分子 →再转化相同受体细胞 → 高频转化子 →基因的进一步证实和鉴定 ? 重组DNA转化细胞 SDS→出现新蛋白质带 原载体转化细胞(一) 分别制备无细胞抽提物 酶活测定→酶活性出现 非转化细胞（二） 免疫分析→与特定抗原反应 ;2．核酸杂交法 1)原理 利用核酸探针与待分离DNA的同源序列可进行杂交的特点分离目的基因（同源序列不是完全相同序列） 优点：不需要基因表达 必备条件：合适的核酸探针或有关资料，外源DNA能在宿主细胞中扩增 2)核酸探针种类 i. DNA探针: 分离自某一种生物 ii.寡核苷酸探针: 根据目的基因编码蛋白质的部分氨基酸序列推测;如：Leu-Val-Phe-His-Asp-Ala 六肽 QUN-GUN-UUQ-CAQ-GAQ-GCN 对应mRNA N：ACGT/U CAN-AAP-GTP-CTP-CG 探针序列 Q：CT/U P：AG 32种14聚体混合物，其中必有一种14聚体与待测DNA完全互补 * 选择的肽段中氨基酸的简并密码子应最少。 **这种探针最好用于目的cDNA分离。若用于分离基因，要事先考虑到此探针序列横跨内含子序列的可能。 ***此种探针亦可根据其他来源相同基因的保守序列设计。 iii. cDNA探针: 利用特异性 mRNA反转录而成，亦可用不同mRNA 混合物反转录而成 iv. PCR探针 v. RNA探针: 由T3或T7启动子和相应聚合酶转录其下游基因片段而得; 3) 分离步骤 基因(基因组或cDNA)文库 →制备DNA样品膜→与标记探针杂交 →杂交斑点（阳性克隆）→分离重组DNA分子 → 作斑点杂交?阳性克隆?Southern杂交以确认杂交结果 → DNA进一步证实和鉴定：核酸序列分析，与蛋白质一级结构比较；分离插入片段进行基因表达，用免疫方法或其他方法检测表达产物;优点：不依赖于基因表达产物的生物学活性,只要抗原决定序列能被正确表达