蛋白免疫印迹法Western blot 原理及步骤.ppt

蛋白免疫印迹法 Western blot Western Blot的原理 Western Blot ：首先利用SDS对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA或脱脂奶粉溶液）处理以封闭NC膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。该技术主要应用于检测蛋白水平的表达。 SDS原理 SDS：是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 强还原剂巯基乙醇等可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物 蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。 Western blot 内容 蛋白样品的制备 SDS转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 步骤 蛋白样品的制备 1，在冰上收细胞，用PBS清洗两次，洗去培养基。1500r,5min离心，弃去上清液。 2，裂解细胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根据所需蛋白浓度加细胞裂解液。混匀。于冰上裂解20min。 3，14000r,10min离心。上清液即为所需蛋白样品液。 4，用Bradford蛋白分析法测蛋白浓度。 5，按100ul裂解液加30ul的6X的loading buffer 的比例，向蛋白样品液中添加loading buffer 。 6，于95℃ ，5min条件下对蛋白样品进行高温变性。 * * SDS: 1，灌胶： （1）保证玻璃板干燥洁净，玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子上准备灌胶。 （2）配好分离胶，加入TEMED，混匀后即可灌胶。灌胶过程中胶要沿着玻璃板流下，防止有气泡产生。将胶灌至接近绿带中线即可。 （3）用去离子水进行液封，胶凝速度会更快（加水时速度要慢，防止胶被冲变形） （4）待水与胶之间有一条折射线的时，说明胶已经凝固。此时，可完全除去胶上层的水。 （5）配制浓缩胶，加入TEMED,混匀后将剩余空间灌满浓缩胶。然后插入梳子。待浓缩胶凝固后小心拔出梳子。 （6）用水冲洗一下胶板，装入电泳槽中（小玻板面向内，大玻板向外；若只跑一块板，槽的另一边要放一块塑料板，有字的一面向外） 2，电泳 向电解槽中加入适量的Running Buffer,将蛋白样品以50ug的标准换算出的体积进行上样。以电压120V或160V进行电泳，电泳至前沿跑至最底端即可进行转膜。 转膜 用硝酸纤维素膜（NC膜），进行转膜。组装转膜“三明治”的过程在Transfer buffer中进行：黑的一面在下，依次放上滤纸、凝胶、NC膜、滤纸，然后合上三明治。整个过程必须保证无气泡。接着把转膜“三明治”放入转膜槽中，注意正负极放置正确。倒入适量的Transfer buffer。在冰浴中进行转膜。转膜条件：120V,1.5h或者150V，1h 封闭 转膜结束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸润于封闭液中，缓慢摇荡1h 一抗杂交 封闭过后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入适量的一抗溶液（一抗：封闭液=1:1000），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育4h。 二抗杂交 一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS进行洗膜，一共洗三次，每次7~10min。然后，再将NC膜放入塑料袋中，加入酶标二抗（一抗的抗体，含辣根过氧化物酶HRP）（二抗：封闭液=1:1000），密封，在摇床上缓慢摇荡孵育45min~1h。最后再次洗膜（同上） 底物显色 取上述处理过的NC膜，于干燥洁净的的玻璃板上，适当晾干。按照体积比1:1取鲁米诺和过氧化氢，混匀，滴加