口蹄疫病毒和伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法的研究（毕业学术论文设计）.docVIP

精品毕业论文 PAGE 分类号： 单位代码：10019 密 级： 学 号：口蹄疫病毒和伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法的研究 张 侃 口蹄疫病毒和伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法的研究 张 侃 学位论文 口蹄疫病毒和伪狂犬病病毒的环介导等温扩增检测方法的研究 Study on Loop-mediated isothermal amplification method for detection of Foot-and-mouth disease virus and Pseudorabies virus 研究生： 指导教师： 吴文学 副教授 申请学位门类级别： 农学硕士 专业名称： 预防兽医学 研究方向： 分子诊断技术 所在学院： 动物医学院 二零一一年五月 摘要 环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技术是一种新颖的核酸扩增方法，仅需一个简单的恒温反应器就能够在等温条件下高特异、高效、快速对DNA进行扩增。与PCR相比，LAMP快速、操作简便、成本低廉，只需要一个小时就能完成检测。另外，通过在反应液中添加羟基萘酚蓝（hydroxy naphthol blue ，HNB），反应结束后即可通过观察颜色变化来判定检测结果。这种不开盖的检测方法，可有效避免产物气溶胶污染和假阳性的产生。 本研究利用一步法反转录环介导等温扩展技术（RT-LAMP）建立了同时检测我国口蹄疫(foot-and-mouth disease virus， FMDV)流行血清型O型、AsiaⅠ型和A型的检测方法。选取在口蹄疫O型、AsiaⅠ型和A型间保守的3D基因为靶序列设计筛选引物，通过试验优化LAMP反应体系的各组分，仅用一个水浴锅，在63℃等温条件下，60分钟内即可通过显色剂观察到明显反应。与OIE推荐的RT-PCR方法的比较结果表明，RT-LAMP方法特异性与RT-PCR方法一致，敏感性是RT-PCR方法的100倍，最低能检出103拷贝的目的基因。对临床样本的检测表明，RT-LAMP检测口蹄疫的检出率高于RT-PCR方法。 同时，本研究还建立了伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）的LAMP检测方法。试验选取保守性较高的gB基因筛选引物，确定反应体系后，可在45分钟内完成检测。LAMP方法特异性与PCR方法一致，敏感性是PCR方法的100倍，最低能够检出到10个拷贝的目的基因。临床样本的检测结果表明，两种方法检出率一致。 关键词：口蹄疫病毒，伪狂犬病病毒，环介导等温扩增（LAMP），PCR，羟基萘酚蓝（HNB）。 ABSTRACT Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method is a novel nucleic acid amplification method which amplifies DNA with high specificity, efficiency, and rapidity under isothermal conditions with only simple incubators. in contrast with PCR,The LAMP assay is easy to perform, extremely rapid, cost-effective, and can be completed within only one hour.Furthermore,by adding hydroxy naphthol blue into the solution,,the result determination can be completed without opening the lid of the tube, which can prevent the false positive and contamination caused by aerosol. Using the Loop-mediated isothermal amplification (LAMP),A diagnostic system for foot-and-mouth disease serotype O、se