三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析-水产学报.PDF

第 ３９卷第９期 水　产　学　报 Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．９ ２０１５年９月 　 ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＦＩＳＨＥＲＩＥＳＯＦＣＨＩＮＡ Ｓｅｐｔ．，２０１５ 文章编号：１０００－０６１５（２０１５）０９－１２９１－１１ ＤＯＩ：１０．１１９６４／ｊｆｃ．２０１４１２０９６０８ 三疣梭子蟹几丁质酶基因的克隆及其在蜕皮过程中的表达分析 １，２ １ ２ ２ １，４ 王　伟 ，　吴旭干 ，　潘桂平 ，　侯文杰 ，　成永旭 （１上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室，上海　２０１３０６； ２中国水产科学研究院东海水产研究所，上海　２０００９０； ３上海市水产研究所及上海市水产技术推广站，上海　２００４３３； ４上海海洋大学上海高校知识服务平台水产动物遗传育种中心，上海　２０１３０６） 摘要：为探究几丁质酶基因在三疣梭子蟹蜕皮过程中的生理作用，本研究通过转录组测序和 ＲＡＣＥ技术克隆了三疣梭子蟹几丁质酶基因（ＰｔＣｈｉ）ｃＤＮＡ全长（登录号：ＫＦ９１４６６３），并通过 荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴＰＣＲ）技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达 情况。结果表明：（１）ＰｔＣｈｉ基因ｃＤＮＡ全长２２００ｂｐ，包括５′非编码区（５′ＵＴＲ）１６ｂｐ、３′非编 码区（３′ＵＴＲ）７１４ｂｐ和开放阅读框 １４７０ｂｐ，编码４８９个氨基酸，预测蛋白质分子量和等电 点为５３９７ｋｕ和４７６。（２）ＢｌａｓｔＰ结果显示，ＰｔＣｈｉ推导氨基酸序列与已知甲壳动物Ｃｈｉ３的 一致性为６１％～９６％，系统进化树分析表明ＰｔＣｈｉ与其他甲壳动物Ｃｈｉ３聚为一支。（３）ｑＲＴ ＰＣＲ结果显示ＰｔＣｈｉ基因在Ｃ期三疣梭子蟹肝胰腺中表达水平最高，胃、大颚器、心脏和眼柄 中ＰｔＣｈｉｍＲＮＡ表达水平依次降低，在其他组织中ＰｔＣｈｉｍＲＮＡ表达量最低，且表达水平无显 著差异。（４）不同蜕皮阶段，ＰｔＣｈｉ在肝胰腺、肠、胃和大颚器４种组织中的表达变化模式有所 不同，肝胰腺中ＰｔＣｈｉｍＲＮＡ表达水平在ＡＢ期最高，Ｃ期最低，暗示ＰｔＣｈｉ可能参与三疣梭子 蟹蜕皮后期对病原体的免疫防御；肠中的ＰｔＣｈｉｍＲＮＡ表达水平在Ｅ期最高，Ｃ期最低，推测 ＰｔＣｈｉ参与蜕皮过程中肠道围食膜的分解和免疫功能；胃中ＰｔＣｈｉ表达水平在 Ｃ期最高，暗示 其参与了食物消化。以上结果表明，本研究克隆的ＰｔＣｈｉ可能为甲壳动物 Ｃｈｉ３型，其准确生 理学功能及其在蜕皮过程中的调控机制有待进一步深入研究。 关键词：三疣梭子蟹；几丁质酶；基因克隆；表达分析；蜕皮周期 中图分类号：Ｑ７８５；Ｓ９６８　 文献标志码：Ａ 　　几丁质又称甲壳素、壳多糖，是由Ｎ－乙酰 － 丁质消化酶的共同参与：首先几丁质酶将几丁质 －Ｄ氨基葡萄糖通过 －１，４糖苷键连接而成 降解为几丁质寡聚糖，随后壳二糖酶将几丁质寡 β β ［１］ 的直链多聚糖 ，是甲壳动物外骨骼的重要组成 聚糖水解为 Ｎ－乙酰 － －Ｄ氨基葡萄糖单 β ［２］ ［６］ 成分 。甲壳动物生长发育过程中，经常需要蜕 体 。水解产生的Ｎ－乙酰 － －Ｄ氨基葡萄糖 β ［３－４］ ［５］ 去旧壳以