细胞活力测定——MTT法.PDF

细胞活力测定——MTT法 培养细胞活力测定  1 细胞克隆形成率实验 单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的 细胞群体形成肉眼可见的克隆。克隆形成率用来表 示细胞的增殖能力  克隆形成率比＝克隆形成数／接种细胞数  缺点：操作繁琐  优点：精确、可靠 2. 化学染色法  死细胞着色法 （台盼蓝、氨基黑、赤藓红B）、活细 胞着色法 （结晶紫、亚甲基蓝、甲苯胺蓝）  台盼蓝法  活细胞不被染色，死细胞染成蓝色，用活细胞占细胞 中的百分比表示细胞活力 3. 比色法——MTT、XTT、CCK8等  四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝 四吐盐比色法的原理：活细胞线粒体中脱 氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物甲 臜（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞 没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积 在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的 formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值  MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、 细胞毒性试验、肿瘤放射敏感性实验等。 操作步骤 3 （1）单细胞悬液接种于96孔培养板；10 - 4 10 细胞/孔，每孔培养基总量100-200微 升（各孔保持一致），37℃、5％CO 培养 2 箱中培养一段时间（待细胞进入指数生长期） （2）根据实验目的加入一定药物或试剂（一般 倍比稀释法设计至少5个浓度梯度，每个浓 度3-5个复孔），培养24、48、72h （根 据具体实验条件而定） （3）加入5毫克／毫升的MTT液（20微升／ 孔）；继续培养4小时。 （4）吸尽孔内培养液后，加入DMSO液 （150微升／孔），将培养板置于微孔板振 荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。 （5）酶标仪检测各孔OD值（检测波,490或 570纳米），记录结果。 经 验  接种96孔板时，细胞一定要混合均匀，每孔加在中间，尽可能不摇 晃，否则液体张力会让细胞移到孔的边缘，影响生长。  96孔板四周的孔一般不作为测量孔。  一定要有对照：  1、空白对照孔（调零孔）（培养液、MTT、DMSO）；  2、正常对照孔（细胞、培养液、MTT、DMSO）  可选3、阳性对照（细胞、已知的有明显作用效果的药物如顺铂、培 养液、MTT、DMSO ）。  可选4、阴性对照（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、 MTT、DMSO） 经 验  MTT避光保存，一般可用1-2周  DMSO 腐蚀微量加样器，切记注意  还可用酸化的10%SDS或5%异丁醇 代替DMSO  还原的MTT在460-630nm均有较好的吸收峰，因此有人用490、 570，也有单波长双波长之分（校正波长630）  在理想的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸 收值应该在0.7-1.2左右，太小检测误差占的比例较多，太大吸收 值可能已经超出线性范围。  建议CCK-8法替代  可用于求药物的IC50 （半抑制率） 实验步骤  1、注意实验过程的记录：详细  2、细胞传代至96孔板（如培养时间较长，可接种密度 3 可选择10 ），注意观察生长状态和加药时间.注意： 一般加药前一天换液  3、加药。柴胡，母液40ug/ul。倍比稀释法稀释 （无 菌状态培养液稀释，稀释倍数各组讨论自定，做好记 录），然后加药，各孔的最终量一致。一般用药终浓度 单位为ug/ml.做好记录  4、培养一定时间后MTT测定不同浓度OD值