《水蛭素-水蛭素》课件.ppt

水蛭素的临床应用 预防外科手术后的静脉血栓形成 预防和治疗（阻断）急性或慢性血管内凝血（DIC） 预防血栓溶解后再栓塞 预防经皮血管腔内形成术（PTCA）后的再狭窄 作为透析和体外循环中的抗凝剂 基因工程技术获取水蛭素 1、获得具有遗传信息的目的基因 2、选择基因载体获得重组DNA 3、将重组DNA分子导入宿主细胞 4、鉴定带有目的基因的克隆 5、目的基因的扩增及获得目的产物 1、获取目的基因 水蛭素的核心环肽结构如下： 2、选择基因载体获得重组DNA 在体外将含目的基因的DNA片段和具有自我复制功能、并带有选择标记的载体分子进行酶切连接，获得重组DNA分子。 可以作为载体的主要有质粒、噬菌体、黏粒、病毒载体等。 影响酶的因素 限制性内切酶（Ⅱ型） 缓冲液：镁离子是酶活性的绝对必需条件，还有氯化钠、二硫苏糖醇及牛血清白蛋白等。 温度：不同限制性内切酶具有不同的最适温度，多数为37℃。 DNA连接酶 大肠杆菌DNA连接酶：以NAD+作为能源 T4噬菌体DNA连接酶：以ATP作为能源 温度：以T4 DNA连接酶为例，连接粘端DNA最佳温度为4~15℃。 3、将重组DNA分子导入宿主细胞 采用特定方法将重组DNA分子转移至适当宿主细胞，并与之同步增殖。 宿主细胞通常为大肠杆菌和酵母菌。 导入方法主要有转化、转染等，也可采用电融合、显微注射和基因枪等技术。 一般不用大肠杆菌作为受体细胞1、需在N端加一个蛋氨酸作为翻译的起始密码，含有多余氨基酸的重组水蛭素活性大大降低。2、水蛭素在大肠杆菌细胞中蛋白质降解作用。 采用酵母（毕赤酵母）作为导入细胞 ⑴真核表达体系，对表达蛋白可进行折叠和翻译后修饰； ⑵表达量高； ⑶较其他真核表达体系成本低，只需含盐的简单培养基； ⑷适于高密度培养； ⑸杂蛋白少，产物纯化较易。 4、鉴定带有目的基因的克隆 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出克隆有重组DNA分子的寄主细胞。 方法： 采用各自特有的测活方法确定其生物活性； 采用酶联免疫方法确定其抗原性； 以目的基因为探针，通过DNA杂交方法可以直接确定重组子。 5、目的基因的扩增及获得目的产物 将重组基因导入受体细胞，使其在新的遗传背景下获得活性表达，从而得到人类需要的特定目的物质。 表达的条件 ①选择合适的载体。 ②表达盒整核位点。 ③要注意选择表达菌株的类型。 ④一般情况下，外源基因整合的拷贝数越高则蛋白表达量越大。 ⑤外源蛋白对蛋白酶的耐受性与否直接影响蛋白产量。 ⑥其他如发酵培养基、通气量、甲醇量等均会对基因表达产物量造成重要影响。 * * 水蛭素 在古代医书《神农本草经》中早有水蛭素的记载，为我国传统中药。中医认为它有破血、逐瘀、通经的功能。它是迄今为止所发现最强的凝血酶天然特异抑制剂。 由于水蛭素具有重要开发价值，而水蛭的来源有限，故国内外医药界均着重研究通过基因工程获得重组水蛭素。 现国外一些大的生物技术公司对水蛭素己进入多方面的临床研究。有关水蛭素类多肽的专利，每年公布的数量至少在十多项以上。 1998年底重组水蛭素药物在德国正式上市，1999年英国批准上市，己注册的国家有美国、欧洲、澳大利亚、新西兰、南非等I0多个国家。 现已知水蛭素有11种类型，其中3种具有抗凝血活性，它们分别命名为HV1、VH2和VH3。 天然水蛭素是酸性多肽，其一级结构中含有6个半胱氨酸，形成3对链内二硫键，位于肽键N端；另一特点是在63位酪氨酸处有硫酸酯化。 1986年科学家从水蛭头部匀浆构建了水蛭素的cDNA文库。根据已测知的氨基酸序列，设计并合成基因探针，从水蛭素cDNA文库中分离出编码水蛭素的cDNA。 氨基酸 密码子 基因探针 提取基因 导入方法： 该菌主要采用形成圆球体、在有氯化锂和聚乙二醇-1000的条件下用整体细胞以及电穿孔等方法进行基因转化。 载体选择： 毕赤酵母载体均为大肠杆菌-毕赤酵母穿梭质粒。故在上一步的载体选择中应选取质粒。 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 毕赤酵母的载体多数以组胺醇脱氢基因(HIS4)作为选择标记。 * *