SDS-PAGE电泳实验步骤.docVIP

垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质 一、实验目的 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。 二、实验原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是： Mr=K(10-b·m) logMr=LogK—b·Rm， 式中 Mr ——蛋白质的分子量； logK——截距； b——斜率； Rm ——相对迁移率。 实验证明，蛋白质分子量在15,000—200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重 复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。 三、试剂及主要器材 1．主要试剂 1)标准蛋白混合液 内含：兔磷酸化酶B(Mw 97,400)，牛血清蛋白(Mw 66,200)，兔肌动蛋白(Mw 43,000)，牛磷酸酐酶(Mw 31,000)和鸡蛋清溶菌酶(Mw 14,400) 2)30％凝胶贮备液：丙烯酰胺（Acr） 29.2g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 0.8g,加双蒸水至100mL。外包锡纸，4℃ 3)分离胶缓冲液(1.5mol／L): Tris 18.17g,加双蒸水溶解,6mol/L HCl调pH8.8,定容100mL。4℃ 4)浓缩胶缓冲液(0.5mol／L): Tris 6.06g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL。4℃ 5)电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris 3g，Gly 14.4g，加双蒸水溶解并定容到1000mL。4℃ 6)10％SDS，室温保存 7)质量浓度10％过硫酸铵(新鲜配制) 8)上样缓冲液：0.5mol／L Tris-HCl pH6.8 1.25mL，甘油2mL，10％SDS 2mL，β-巯基乙醇1mL，0.1％溴酚蓝0.5mL，加蒸馏水定溶至10mL。 9)0.25％考马斯亮蓝R-250染色液：0.25g考马斯亮蓝R250，加入91ml50%甲醇，9ml冰醋酸 10)脱色液：50ml甲醇，75ml冰醋酸与875ml双蒸水混合 11)未知分子量的蛋白质样品(1mg／mL ) 2．实验器材 DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂) 电泳仪 长滴管及微量加样器 烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 25