槐耳清膏抑制人前列腺癌PC3细胞增殖与侵袭作用及其机制研究お.docVIP

槐耳清膏抑制人前列腺癌PC3细胞增殖与侵袭作用及其机制研究お 　　[摘要]该研究探讨槐耳清膏对人前列腺癌PC3细胞增殖和侵袭的抑制作用及其相关分子机制。采用CCK8法检测槐耳清膏对PC3细胞的增殖抑制作用。采用流式细胞术分析槐耳清膏给药后PC3细胞凋亡及细胞周期的变化。采用细胞划痕实验及Transwell侵袭实验分析给药后PC3细胞侵袭与迁移能力的变化。通过Western blot法，检测槐耳清膏给药后与侵袭迁移相关的EMT蛋白标志物表达水平的变化及MAPK信号通路中关键蛋白磷酸化水平的变化。结果显示，槐耳清膏可以明显抑制人前列腺癌PC3细胞的增殖。槐耳清膏8 g?L1作用于PC3细胞4.8 h后，细胞凋亡率较对照组明显升高，且细胞发生明显的S期阻滞。槐耳清膏给药后可以明显降低PC3细胞的侵袭与迁移能力，并且能够下调Ncadherin和TCF8/ZEB1的表达水平和上调Ecadherin的蛋白表达水平，表明槐耳清膏能够促进PC3细胞MET的发生，同时还发现MAPK信号通路中的关键蛋白JNK和ERK的磷酸化水平明显下降。因此，槐耳清膏能够抑制人前列腺癌PC3细胞增殖和迁移侵袭能力，这可能与其调控EMT及抑制MAPK信号通路有关。 　　[关键词]槐耳清膏； 前列腺癌； 增殖； 侵袭； MAPK信号通路 　　前列腺癌是全球范围内男性第二位最常见的癌症，其发病率已占我国男性泌尿系统肿瘤之首[1]。化疗药物治疗、激素治疗等成为主要的治疗手段，然而较大的细胞毒性、抗药性及高成本等缺点紧随其来，越来越多的目光转向了低毒性、多靶点、疗效良好的天然药物上来。 　　槐耳[2]为多孔菌科真菌槐栓菌Trametes robiniophila Murr的干燥子实体。槐耳作为一种传统中药，在中国已有1 600余年的应用历史，其单味药物、提取物以及用于癌症辅助治疗的槐耳颗粒在近年来都受到学者们的广泛关注，基础研究以及临床应用已经证实了其具有良好的抗癌效果。本研究采用CCK8法，流式细胞术，Western blot及细胞划痕与Transwell侵袭实验，研究槐耳清膏对人前列腺癌PC3细胞的作用及相关机制，以期对槐耳抗前列腺癌作用深入研究和临床应用提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1药物与试剂槐耳清膏来自于江苏盖天力药业有限公司，溶于F1.2K完全培养基中配成10 g?L-1母液，02.2 μm滤膜过滤除菌待用。人前列腺癌细胞系PC3细胞购于中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。F1.2K基础培养基，胎牛血清，青霉素链霉素混合液，02.5%胰蛋白酶EDTA，Matrigel胶，Transwell小室均购于美国Corning公司；CCK8细胞增殖和毒性检测试剂盒购于日本同仁化学研究所；流式凋亡检测试剂盒购于美国BD公司；细胞周期检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；βactin购于美国Abgent公司；ERK，pERK，JNK，pJNK，Ecadherin，Ncadherin，TCF8/ZEB1购于美国CST公司；HRP标记的羊抗鼠/兔购于Santa Cruz公司；4%～1.2% BisTris NuPAGE凝胶购于美国Invitrogen公司；SuperECL Plus超敏发光液购自北京普利莱基因技术公司。 　　1.2细胞培养人前列腺癌细胞系PC3细胞用F1.2K完全培养基培养（含有10%的FBS，100 U?mL-1青霉素，100 g?mL1链霉素）。细胞培养条件为3.7 ℃，5% CO2，饱和湿度培养。 　　1.3CCK8细胞增殖毒性试验取对数期生长的细胞制备细胞悬液，调整细胞数量为3.5×104个/mL，加入96孔板，每孔100 μL。细胞培养2.4 h使其完全贴壁，将槐耳清膏用完全培养基稀释成不同浓度的工作液，每个浓度设置5个复孔。分别于加药后2.4，4.8，72 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，在3.7 ℃作用2 h。用酶标仪测定在4.50 nm处的吸光度，计算细胞存活率。 　　1.4流式细胞仪检测细胞凋亡PC3细胞以适当浓度接种在6孔板中，过夜贴壁后，分别加入终浓度为0，4，8 g?L-1的槐耳清膏，培养4.8 h，按Annexin VFITC/PI检测试剂盒方法操作进行，运用流式细胞仪分析，计算细胞凋亡率。 　　1.5 流式细胞仪检测细胞周期PC3细胞以适当浓度接种在6孔板中，过夜贴壁后，分别加入终浓度为0，8 g?L-1的槐耳清膏，培养4.8 h，按细胞周期检测试剂盒方法操作进行，运用流式细胞仪分析。 　　1.6 细胞划痕试验PC3细胞接种在1.2孔板中，待细胞处于亚融合状态时，换用无血清的F1.2K培养基饥饿培养1.2 h。用10 μL的白色枪头垂直轻柔划痕。1×PBS清洗因划痕而飘起的细胞碎片，拍照