密度梯度法分离小鼠淋巴细胞.docVIP

密度梯度法分离小鼠淋巴细胞 实验目的 掌握密度梯度法分离单个核淋巴细胞 实验原理 红细胞和多核白细胞的比重（1.092左右）比淋巴细胞的比重（1.075-1.090）大，因此利用一种比重介于1.075~1.092之间的等渗溶液（淋巴细胞分离液）作密度梯度离心，使不同比重的细胞按不同的密度梯度分布。 实验试剂和器材 Balb/c鼠，1640培养基，淋巴细胞分离液，镊子，剪刀，金属网，研棒，平皿，枪头、15ml离心管、移液器、离心机、白瓷盘、酒精棉球、烧杯。 实验步骤 1、对Balb/c鼠先用摘眼球放血并拉脊椎处死。 2、用酒精棉球擦拭小鼠腹部，用剪刀和镊子在腹部剪开一个小口，用手撕开小鼠的皮毛，使肌肉裸露，用剪刀和镊子剪开肌肉，取脾脏。去除血细胞及脂肪组织，用2ml 1640进行清洗。 3、将清洗过的脾脏放到置于平皿中的金属网上，先加入1ml 1640，用研磨棒压碎脾脏成单细胞，补加2ml 1640冲洗金属网。 4、将研磨的单细胞悬液小心的靠壁滴加入5ml体积的淋巴细胞分离液的液面上（小心不破坏淋巴细胞分离液液面），2000r/min，离心20min，此时离心管中由上至下细胞分四层。用枪头小心吸取第二层的环状乳白色淋巴细胞层，放入加入了约10ml的PBS的离心管中，充分混匀，1500r/min，离心5min，弃上清。剩余约100ul PBS，重悬，混匀，即得淋巴细胞悬液。 实验结果 1、离心后溶液分为四层，最上层为粉红色澄清液体，第二层处于分界处，稍微发白模糊，第三层为透明状液体，有少量絮状漂浮物，最下层为深红色沉淀。 2、最后得到的淋巴细胞悬液较为浑浊，颜色发白。 实验分析及讨论 （一）实验讨论 1、淋巴细胞分离液看起来是无色透明的，实际上由两种糖分构成，具有梯度，故可以对淋巴细胞产生分离作用。 2、再去脾脏前要确保小鼠已被处死，避免小鼠挣扎造成污染。 3、在解剖前用酒精棉球擦拭小鼠腹部，即可起到消毒作用，又可以弄湿鼠毛露出皮肤，方便解剖。 4、解剖时可先在小鼠皮毛上剪一小口，用手撕开使皮毛与肌肉分离，再剪开肌肉取出脾脏。用手撕开皮毛可以较好地暴露肌肉，较干净，若直接剪开腹腔，每剪一刀都会减掉鼠毛，容易粘在脾脏上易造成污染。 5、由于脾脏（呈细长鞋垫状）位于小鼠腹腔左侧且靠近体表，故解剖时可以使小鼠左侧向上侧躺，方便取出脾脏。 6、研磨脾脏时要上下按压，稍加用力即可破碎，不要太用力，不要来回磨，由于金属网是100目的，过网流到平皿里的即为单细胞。 7、清洁金属网时，反面向上冲洗，不可用金属刷刷，以免破坏金属网使孔径变大。 8、收集于平皿中的细胞悬液要吹洗一下防止细胞贴壁。 9、滴加细胞悬液时要靠壁滴加，不要大力充加，避免将细胞悬液冲到分离液下层，破坏液面，破坏分离效果。 10、液面分层后可先吸出部分1640再将枪头直接伸进去小心的转着圈吸取淋巴细胞悬液。 11、1640加了粉红色方便观察分界处。 取脾脏前先放血是因为脾脏不仅是淋巴细胞聚集地，也是储血器官。 处理活细胞时尽量在冰水浴中操作以免细胞失活。 结果分析 离心后溶液分为四层： 最上层的粉红色澄清液体为1640； 第二层处于分界处，稍微发白模糊的为淋巴细胞所在处； 第三层为透明状液体，有少量絮状漂浮物可能是研磨不充分没有形成单细胞的多细胞悬浮物； 最下层为深红色沉淀，可能是红细胞、白细胞的沉淀物。 分层较为成功，说明成功分离到了小鼠淋巴细胞。