尺寸排阻色谱课件.ppt

分子尺寸色谱的分类及应用 FYN 概述 原理 分类 应用 概述 分子尺寸色谱法又称分子排阻色谱法（SEC）主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。 优点： 根据分子大小，可预测分离； 分离过程中无样品损耗和反应发生； 柱几乎不失活，寿命长； 缺点： 不能分辨分子大小相近的化合物,分子量大小相差大于10%才能得以有效分离! 原理 前面已经说了凝胶的表面是有小孔的，像右图所示那样，样品中分子小（分子量小）的成分③进入了孔的最深处。分子大（分子量大）的成分①无法进入孔穴。而分子量居中的②只能进到孔穴的一半深度。能够进入孔穴的成分在色谱柱中保留的时间比较长，所以样品从色谱柱脱离的顺序依次为①、②、③。像这样，尺寸排阻法是利用样品中各分子的分子量大小顺序而分离出来的。 在尺寸排阻色谱法中特别要注意的是，分子量很大的物质不一定实际的分子体积也很大。就像右图所示，两种物质的分子量相同，因为结构的紧密度不同，所以分子的大小也不相同。另外还需要注意的是即使是用一种物质，在不同的流动相中构造也会变的分散或紧密，实际的大小会发生变化。 分类 流动相为有机溶剂：凝胶渗透色谱：GPC （或称为油溶性SEC） 流动相为水：凝胶过滤色谱：GFC （或称为水溶性SEC） 凝胶渗透色谱（GPC） GPC（油性SEC）通常使用聚合物色谱柱。聚合物色谱柱最常用的填料是聚苯乙烯（准确的说应该是苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物）。 GPC分析的时候，首先必须选择能溶解样品的溶剂。GPC用的溶剂最常用的是THF（四氢呋喃）。如果THF能溶解样品的话那当然没问题，如果不能溶解的话就必须寻找能使之溶解的溶剂。除了THF，常用的GPC流动相还有氯仿，DMF（二甲基甲酰胺），HFIP（六氟异丙醇），喹啉，二氯苯，乙酸甲酯，四氯乙烷等。一般来说就把能溶解样品的溶剂直接当成流动相来使用。 凝胶过滤色谱（GFC） GFC（水性SEC）用的色谱柱分硅胶基质色谱柱和聚合物基质色谱柱。这两种做比较，硅胶色谱柱的校正曲线比较平缓，所以硅胶柱的分离性能比较好。然而，硅胶填料如果开大点的孔硅胶的结构会被破坏，所以就不能做成排除界限分子量大的凝胶。与此相对，聚合物的构造与硅胶相比更加坚固，可以开较大的孔。而且，聚合物填料的化学性质也比硅胶稳定，可以作为流动相使用的溶剂的选择范围非常广，这也是聚合物色谱柱的一个特点。 硅胶柱可以用来分析以蛋白质为代表的糖蛋白，肽，核酸等物质。 聚合物色谱柱，除了和硅胶柱同样的使用以外，还能用来进行硅胶柱不能测定的分子量大的水溶性超高分子的分子量测定。 应用 分子量分布的测定 　(C6H5CH=CH2)聚苯乙烯是由无数个苯乙烯分子聚合而成。由于苯乙烯的分子量是104（＝12×8＋1×8），所以分子量为104万的聚苯乙烯分子是由1万个苯乙烯分子聚合而成的。然而，实际的聚苯乙烯制造过程中，不能单独生产1万个苯乙烯聚合而成的产物。所以在制造聚苯乙烯的过程中，除了10000个聚合的产物，10012，9985类似这种聚合物也被制造出来，形成了以10000个为中心的分子带。这就是分子量的分布。 为了计算分子量的分布，必须先做标准曲线。这就必须用已知分子量的聚苯乙烯作标准试剂来进行测定。比如，根据（图-1），可以由各分子量（MW : Molecular Weight）对应峰顶点来求其溶出对应的时间（溶出时间=Rt : Retention time）。如（图-2）a）所示，纵轴表示分子量，横轴表示溶出的时间，把每个点连接起来即成校正曲线。然后，进行待测聚苯乙烯的分析，得到了像b）那样的谱图。这个峰是第13.9分钟时开始脱出，第18.8分钟时结束的，这种那个聚苯乙烯的分子量就在6200至1,100,000的范围内。 图-1 图-2 目前为止的分离模式都是利用凝胶和各样品中的化学或者电化学性质来进行分离的，接下来要说明的尺寸排阻模式是和这些完全不同的，利用各成分的物理性质来进行分离的模式。 * 尺寸排阻色谱柱为了方便根据待测成分的分子量来选择合适的色谱柱，按照凝胶表面孔的大小分成了很多种类。各种色谱柱的排阻界限分子量在产品目录上都有详细记录，使用的时候要按照待测样品最大分子量不超过色谱柱的排除界限分子量的规则来进行选择。另外，在不超过排除界限分子量的前提下，尽量选择排除界限分子量小的