降血糖药物筛选方法课件.pptVIP

1. 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗实验 脂肪细胞 11mM葡萄糖 含药培养液 培养24或48 h 检测培养液中 葡萄糖消耗量 葡萄糖氧化酶法 计算葡萄糖 消耗量 阳性药物可选择二甲双胍 糖消耗量(mM)=11mM-培养基葡萄糖浓度(mM) 2. 3T3-L1脂肪细胞葡萄糖转运实验 脂肪细胞 加药 培养24h 0.5 uCi/ml 2-deoxy-[H ]-D-glucose 3 孵育10min 加NaOH 裂解细胞 细胞 裂解液 KRP 缓冲液 清洗3次 [H ] 含量 同位素 测定仪 KRP缓冲液组成：131.2 mM NaCl，4.7 mMKCl，2.47 mM CaCl2， 1.24 mM MgSO4, 2.48 mM NaH2PO4, 10 mM HEPES 3 b-细胞损伤模型 H2O2 链脲霉素 四氧嘧啶 b-细胞胰岛素分泌模型 b-细胞ATP敏感钾通道阻断剂 四、分子水平降糖药物筛选 4.1 a-糖苷酶抑制剂筛选 原理： 饮食中淀粉和蔗糖(双糖)不能直接被肠壁细胞吸收，需要在小肠绒毛上的多种α-葡糖苷酶的作用下生成单糖(葡萄糖及果糖)后才能被吸收。 α-糖苷酶上具有与寡糖及双糖相结合的位点，药物与这个位点结合，能可逆性地抑制小肠绒毛上的多种α-葡糖苷酶的活性。 α-糖苷酶有多种，包括：蔗糖酶；葡萄糖淀粉酶；麦芽糖酶；糊精酶。 阿卡波糖 阿卡波糖与α-蔗糖酶结合位点 方法： p-NPG(底物) 磷酸缓冲液 0.2U/ml a-糖苷酶 一定浓度药物 保温 30 min Na2CO3 终止反应 405 nm测定释放p-NP量 p-NPG为对硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（无色） p-NP为对硝基苯酚（黄色） 4.2 蛋白质酪氨酸磷酸酶-1B (PTP-1B)抑制剂筛选 原理： 蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)是胰岛素信号转导通路的负调节因子，与II型糖尿病密切相关。 PTP-1B过度表达将会使胰岛素受体去磷酸化，无法与胰岛素结合，引起胰岛素抵抗。 方法： 结果： p-NPP液 PTP-1B酶液 一定浓度药物 37 度孵育 0 min 405 nm处 测定吸光度 OD值 PTP-1B活性= （给药组OD10min-给药组OD0min) （对照组OD10min-对照组OD0min) x100% 37 度孵育 10 min p-NPP为对硝基苯磷酸酯(无色)；p-NP为对硝基苯酚(黄色) 总　结 一、动物水平筛选 模型： I型（链霉素诱导高血糖动物模型） II型（高脂饮食、PO大鼠） 药效评价： 血糖测定（葡萄糖氧化酶法、己糖激酶法、血糖仪） 糖耐量试验； 胰岛素释放试验； 胰岛素敏感性试验(葡糖钳技术) 二、细胞水平筛选 葡萄糖消耗、转运试验 三、酶和受体水平筛选 a-糖苷酶抑制剂 PTP-1B抑制剂； 思考题：中药多糖会不会升高血糖？ 降血糖药物筛选方法 2010年11月5日 导论 动物水平筛选 细胞水平筛选 酶和受体水平筛选 总结和思考 糖尿病（DM, Diabetes Mellitus） 糖尿病为一种多病因的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。 指标： 餐后2 h 血糖高于11.1 mmol/ L 空腹血糖高于7.0 mmol/ L 　 发病率 全球糖尿病患者人数已超过1.77亿，预计到2025年将达到3.7亿，成为继心血管和肿瘤之后第三位“健康杀手” （WHO）。 中国糖尿病发病率达5%，全国糖尿病患者人数已在3000万以上，糖尿病患者的人数仅次于印度居世界第二位。 世界糖尿病日 纪念胰岛素的发现者班廷的诞辰，世界卫生组织（WHO）和国际糖尿病联盟（IDF）将班廷医生的生日11月14日定为世界糖尿病日（WDD）。 班廷，Banting， 加拿大生理学家 （1891-1941） 控制糖尿病，刻不容缓！ （Lets?take?control?of?diabetes.?Now！） 并发症 糖尿病可导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭、神经病变、肢体坏疽以致截肢、昏迷等多种并发症。