大鼠皮层神经元细胞原代培养课件.pptVIP

皮层神经元细胞原代培养 ? 主要内容 : 实验原理 1 准备工作 2 实验步骤 3 影响因素 4 实验原理 ◆细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一。可分为原代培养和传代培养两种。 ◆原代培养：将动物机体的各种组织从机体中取 出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 仪器、材料与试剂 无菌操作台，培养箱 实验仪器 培养板，青霉素瓶，离心机，计数板 冰盒，滤器（200目自制），手术器械 新生鼠 DMEM F12培养基（ 20% 血清）， 025%胰酶 多聚赖氨酸，碘酒， 75% 酒精，PBS，阿糖胞苷 实验准备 材料与试剂 实验准备 实验前准备工作 培养板包被 培养基，阿糖胞苷配制 制备冰盒 0.1 %多聚赖氨酸包被 胰酶消化法 1 准备： 取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒30分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手及台面。 2 布局： 点燃酒精灯，安装吸管帽；准备离心管； 平皿及器械放置妥当。 实验步骤 实验步骤 布局 酒精 PBS 冰盒 PBS PBS 器械 剥离血管及筋膜 取脑，分离皮层神经元 清洗血液 断头 剪碎组织块 3 断头取脑： 超净台内，断头取脑，置于盛有PBS的培养皿内，洗涤3次，弃除表面残余血迹，迅速置于无菌的生理盐水冰浴上。 4 剥离软脑膜： 剥离大脑皮层至预冷的PBS中，用两把无齿弯镊仔细剥离软脑膜和血丝，剥离干净后用PBS液洗2-3遍。 实验步骤 5 剪碎： 将大脑皮层转移到另一装有PBS的平皿中，用手术剪将其剪成小块（1mm3），用PBS液洗三次，转移至离心管中离心1000 rpm? 5min 。 6 消化： 加入0.25%胰蛋白酶，放入37℃培养箱消化20min,中间翻转振荡一次。使细胞分离。 实验步骤 7 终止消化： 用含20%血清的DMEM-F12培养液终止消化，轻轻用吸管吹打均匀， 离心1000 rpm? 10min。 8 过筛网： 弃去上清液，加入20%血清的DMEM-F12培养液，轻轻用吸管吹打均匀，200目尼龙网过滤。 实验步骤 9 细胞计数： 　4个大方格内细胞总数　 ──────────　 ×　10４×n(稀释倍数)　　　　　　　4 10 种 板： 以5×105 个/ml接种于用多聚左旋赖氨酸包被过的培养板内，培养板置细胞培养箱中37℃、5%CO2、饱和湿度下进行培养 实验步骤 5 纯化： 培养48小时全量换液，加入终浓10μmol/l 阿糖胞苷的培养液。 目的：抑制质细胞等非神经元细胞的生长。 实验步骤 培养基 材料 剥膜 包被 消化 低温操作 影响因素