13 第13章 免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用.pptVIP

第十三章 免疫细胞分离与免疫细胞功能检测及应用 授课教师：程真珍 学时数：2学时 教学目的： 熟练掌握免疫细胞的分离技术、细胞表面标志的检测和T细胞亚群、B细胞、NK细胞的检测，了解免疫细胞的功能检测和临床应用。 教学要求 1、掌握外周血单个核细胞的概念及其分离方法（Ficoll液分离法） 2、掌握淋巴细胞表面标志的检测及亚群的分类。 3、了解免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用。 教学重点与难点 重点：淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类 难点：免疫细胞的分离 第一节 免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离 T、B细胞和T细胞亚群的分离 分离免疫细胞的样本来源 外周血 脾脏 淋巴结 胸腺 骨髓 分离免疫细胞的目的 检测免疫细胞的数量和功能，观察机体免疫状态 免疫细胞的细胞生物学研究 免疫细胞的培养和建株 细胞分离基本原理 物理学和生物学特征 密度大小 表面标志 其它活性：吞噬、黏附等 一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。 不同细胞密度不同 聚蔗糖（Ficoll）－泛影葡胺分层液法 （一）原理和方法 3. 离心分离：将细胞叠加在密度合适的分层液(1.075-1.09) 上层，经离心后细胞可分为不同的区带。 （二）方法评价 是分离PBMC最常用的方法 操作简单，不需特殊仪器设备 分离纯度高，可达95％ 细胞得率高，可达80％ 二 、淋巴细胞分离 贴壁粘附法 吸附柱过滤法 Percoll 分离液法 （连续密度梯度离心） 贴壁粘附法 单核细胞－－贴壁生长 玻璃、塑料平皿/培养瓶、37℃、1h 取未贴壁细胞------淋巴细胞（T、B） 刮下贴壁细胞------纯单核细胞 缺点：B细胞也有较弱贴壁，使B细胞收率↓ 吸附柱过滤法 层析过柱，单核细胞滞留于层析柱中 洗脱------淋巴细胞 层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶 粘附能力：Mф、Mon＞DC ＞BC ＞ TC=RBC Percoll分层液法 Percoll分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒、无刺激。 Percoll原液加PBS稀释，高速离心（21000g）连续密度梯度。 三 T、B细胞和T细胞亚群的分离 磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法 磁性微球分离法 原理： 将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 （Immunomagnetic bead，IMB） 第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（Cluster of differentiation，CD）。 细胞表面分化抗原（CD抗原） 一、T细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg） 辅助性T细胞 细胞毒性T细胞TC1:CD3+CD8+CD30-TC2:CD3+CD8+CD30+ 调节性T细胞 自然存在的调节性T细胞CD4+CD25+Foxp3+ 诱导产生的调节性T细胞（Tr1和Tr3） 二、B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，小鼠红细胞受体是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 三、NK细胞表面标志 人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞认定为NK细胞。 第三节 其他的免疫细胞 抗原提呈类细胞表面标志 第四节 淋巴细胞的功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定 淋巴细胞 T细胞（负责细胞免疫功能） B细胞（执行体液免疫功能） NK细胞（非特异性免疫作用） 一、T细胞功能的检测 T细胞增殖试验 T细胞分泌功能测定 T细胞介导的细胞毒试验 体内试验 （一）T淋巴细胞增殖试验 1. 原理： 2.