实验5、叶绿体色素提取及含量测定.pptVIP

实验5 叶绿体色素的提取与含量测定 一、目的 掌握叶绿体色素的提取方法与含量测定方法 二、原理 1、提取原理：叶绿体色素是酯类化合物均不溶于水，而溶于含有水的有机溶剂，故常用95％的酒精和80％丙酮提取，或用酒精、丙酮和水的混合液提取。叶绿体色素易受光氧化，提取色素应在弱光中进行，并避光保存色素。新鲜的叶片可用无水丙酮提取。叶干粉用85％丙酮提取。 2、测定原理 根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。 根据朗伯–比尔定律，某有色溶液的消光度 D 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即： D = kCL （ 1 ） 式中： k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， k 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。 如果溶液中有几种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的消光度 D ，并根据叶绿素 a 、 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a 、 b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。 已知叶绿素 a 、 b 的 80 ％丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为 663nm 和 645nm ，又知在波长 663nm 下，叶绿素 a 、 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27 ，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.60 ，根据加和性原则列出以下关系式： D 663 = 82.04C a +9.27C b （2 ） D 645 = 16.75C a +45.60C b （ 3） 式中： D 663 和 D 645 ：叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度； C a 和 C b ：叶绿素 a 和 b 的浓度mg/L 。 解方程组 （2）和 （ 3）得： C a = 12.72D 663 – 2.59D 645 （ 4） C b = 22.88D 645 – 4.67D 663 （5 ） 将 C a 与 C b 相加即得叶绿素总量 C T ： C T = C a +C b =20.29D 645 + 8.05D 663 （ 6） 另外，由于叶绿素 a 、 b 在 652mn 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5 ），也可以在此波长下测定一次消光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、 b 总量： C T = （ D 652 × 1000 ）／ 34.5 （ 7 ） 在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80 ％丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式： C a = 12.21D 663 – 2.81D 646 （ 8 ） C b = 20.13D 646 – 5.03D 663 （ 9 ） C x = （ 1000D 470 – 3.27C a – 104C b ）／ 229 （ 10 ） 式中： C a 、 C b —叶绿素 a 和 b 的浓度。 C x —类胡萝卜素的总浓度。 D 663 、 D 646 和 D 470 —叶绿体色素提取液在波长 663 nm 、 646 nm 和 470 nm 下的消光度。 由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素 a 、 b 在 95 ％乙醇中最大吸收峰的波长分别为 665nm 和 649nm ，类胡萝卜素为 470nm ，可据此列出以下关系式： C a = 13.95D 665 – 6.88D 649 （ 11 ） C b = 24.96D 649 – 7.32D 665 （ 12 ） C x = （ 1000