10种金发藓科植物RAPD分子系统学的研究.docVIP

10种金发藓科植物RAPD分子系统学的研究 　　摘要：利用改良CTAB法提取10种金发藓科（Polytrichales）植物基因组DNA，利用RAPD和分子标记技术对其进行遗传多样性研究。结果表明，在供试材料中筛选到具有多态性的RAPD引物12个，这些RAPD引物共扩增出68条带，多态性带42条，多态性条带比率（PPB）为61.76%；采用UPGMA聚类分析，供试材料分为2大类群，细叶拟金发藓单独聚为1类，其余9种植物聚为1类。RAPD和分子标记技术可用于金发藓科植物系统学研究。 　　关键词：金发藓科；RAPD；系统学；遗传多样性 　　中图分类号：Q75文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）11-0058-03 　　金发藓科（Polytrichales）为金发藓目中唯一的1个科，全世界共有19个属，其中，Eopolytrichum为1个化石属[1]。Schofield保守估计认为金发藓目大约有370种[2]，但新近判断认为，该目实际上的种数不超过200种[3]。对金发藓科一些属种的分类地位，不同学者有不同的认识[4-8]。吴鹏程等将穗发藓属的主要种类及拟仙鹤藓属和新金发藓属归并入小金发藓属；将金发藓属中孢蒴口部盖膜呈肉质的种划入拟金发藓属[9]。Zouhair等利用随机扩增引物对金发藓属6种植物进行RAPD分析，共获得166条多态性DNA片段，根据RAPD分子标记结果，将6种植物分为2大类群，即金发藓、拟金发藓和P.c.var.perigoniale为1类，桧叶金发藓、毛尖金发[LL]藓和P.strictum为1类，第1大类中金发藓与拟大金发藓之间的亲缘关系更近一些[10]。金发藓科的许多植物在经典分类学上分类地位不清，且一些分子标记的试验结果与经典分类学结论相悖，这为金发藓科系统学研究提供了更广阔的空间。本研究采用RAPD分析方法，对金发藓科10种藓类植物进行遗传聚类分析，以期为更好地研究藓类植物的分类地位奠定基础。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　供试材料为自然风干的标本及2012年采集的新鲜标本，材料种名、采集地等信息见表1。 　　1.2仪器及药品 　　1.2.1仪器美国产PE-9600型PCR仪；北京六一仪器厂产DY-3型电泳仪和DYCP-33A型水平板电泳槽；日本产7A0-0012型GeneSpecl、SANYO制冰机和NUALR-6382E型超低温冰箱；河北省黄骅航天仪器厂产DZKW-D型水浴锅；德国产高速冷冻离心机HERMLEZ323K；1mL和20、200、100μL微量加样器；UVPGDS-8000型紫外凝胶成像系统；Barnstead纯水仪；PHS-25型酸度计；北京赛多利斯天平有限公司产电子天平。 　　1.2.2药品Tris、HCl、EDTA、NaOH、溴化乙锭（EB）、乙酸钠、冰乙酸、TE、CTAB、NaCl、TBE、乙醇、氯仿、异戊醇、溴酚蓝、蔗糖、抗坏血酸钠、PVP和3%β-巯基乙醇等，均为分析纯（AR）；4种dNTP、TaqDNA聚合酶及A、B、C、D、H、Y组引物，均为上海生工生物工程股份有限公司产品；DGL2000Marker，为大连宝生物公司产品。 　　1.3试验方法 　　1.3.1DNA提纯、保存及检测采用改良CTAB法提取试材DNA；放入-20℃冰箱储存或放入4℃冰箱待用；利用核酸检测仪通过紫外吸收法对DNA样品进行定量分析和纯度检测，并用琼脂糖电泳检测DNA。 　　1.3.2RAPD扩增 　　1.3.2.1扩增反应体系RAPD扩增体系总体积为25μL，其中，10×buffer、25mmol/LMg2+、10mmol/LeachdNTP、25g/LTemplateDNA、5000U/mLTaqpolymerase和10mmol/LPrimer等组分体积分别为2.5、2.0、1.0、1.0、0.3、0.8μL，用无菌ddH2O补足。 　　1.3.2.2扩增反应程序94℃2min；94℃1min，36℃1min，72℃2min，43个循环；72℃5min，1个循环。 　　1.3.2.3RAPD反应体系的优化RAPD反应体系为25μL，扩增引物为A11。针对反应体系中模板DNA、dNTP、引物和Taq酶浓度等4个组分，L16（54）正交试验基础上进一步进行L9（43）正交设计（表2、表3），以寻求最优方案。 　　1.3.4扩增产物的检测扩增结束，在反应混合物中加入5mL/L上样缓冲液，混匀；取15μL点入1.5%琼脂糖凝胶中，用0.5×TBE电泳缓冲液在3V/cm（84V）电场下电泳2～3h，经0.25mg/L溴化乙锭染色30min，在紫外凝胶成像系统下观察照相和分析。 　　1.3.5引物筛选正式扩增前，任意选取系统进化差异较大的2个