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3种的方法检测念珠菌对氟康唑敏感性评价 　　【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672－3783(2012)04－0267－01 　　【摘要】目的：评价3种真菌药敏方法检测念珠菌对氟康唑敏感性的相关性，从而选择一种易于在各临床实验室开展、准确、简便的检测方法，以期更好的指导临床用药。方法：分别用ROSCO纸片扩散法、液体培养基微量稀释法、ATBFUNGUS3浓度梯度法检测82株念珠菌对氟康唑的敏感性，以CLSI推荐的微量肉汤稀释法作为参考方法。结果：与液体培养基微量稀释法检测结果相比，ROSCO纸片扩散法一致性为91.5%；ATB浓度梯度法一致性为87.7%，均无一种方法敏感而其他2种方法为耐药或一种方法耐药而其他2种方法为敏感的严重误差。结论：ROSCO纸片扩散法法对氟康唑的检测结果与CLSI推荐的液体培养基微量稀释法相比符合率好，准确率高，监测的抗真菌药物种类多，更适合在临床实验室推广应用。 　　【关键词】念珠菌，氟康唑，真菌药物敏感试验 　　近年来，机会性真菌感染发病率的不断上升及其耐药菌株的逐渐增多使真菌病的治疗面临着严峻的挑战。氟康唑其作用机制是通过抑制14a脱甲基酶，使麦角固醇合成受阻，导致真菌细胞膜的完整性受损，从而发挥其抗真菌作用［1］。但是氟康唑长期反复治疗易导致耐药菌株的出现，因此合理使用抗真菌药物和耐药性的检测具有重大意义。但是，临床真菌药物敏感试验一直存在一些问题，如：现有的真菌药敏试验的可操作性和重复性不理想，需要进一步提高；真菌药敏折点需要改善；药敏试验的操作需要规范，并且需做好质量控制等。因此，本研究通过比较3种不同药物敏感性方法检测念珠菌对氟康唑敏感性的相关性，从而选择一种易于在各临床实验室开展的准确、简便的检测方法，更好的指导临床用药。 　　材料和方法 　　1．材料 　　1.1实验菌株 　　实验菌株来自广东省肇庆市皮肤病医院检验室2010年1月至2011年4月病人阴道分泌物等标本中分离出的82株念珠菌。其中白念30株，热带15株，光滑23株，近平滑14株。实验所用82株念珠菌的菌种构成如表1。 　　1.2标准菌株 　　采用白假丝酵母菌ATCC90028，购自广东省临床检验中心。 　　1.3培养基与鉴定试剂 　　RPM1640液体培养基、真菌药敏平板（ROSCO），念珠菌显色平板培养基（江门市凯林贸易有限公司），真菌药敏试剂条ATBFUNGUS3（法国生物梅里埃），96孔板（广州和达生物科技有限公司），氟康唑纸片（ROSCO）以及氟康唑药粉（海南曼克星制药厂，纯度99.45％） 　　2．方法 　　实验菌株在念珠菌显色平板及沙保氏平板共转种两次，挑取于沙保氏平板上培养24~48h的单个菌落进行药敏实验。 　　2．1ROSCO纸片扩散法： 　　参考2003年美国临床实验室标准化委员会（NCCLS，后更名为CLSI）推荐了纸片扩散法M44-P实验菌株转种两次后，挑取单个菌落用无菌生理盐水调整比浊至0.5个麦氏单位。用无菌棉签蘸取菌液在试管内壁旋转挤去多余菌液，从3个方向（角度为60°）均匀涂布在真菌药敏平板上。涂布平板后室温放置15min贴上氟康唑纸片，35℃孵育24h后读取氟康唑抑菌环直径(mm)，结果读取依照参考文献说明［3］。 　　2．2ATBFUNGUS3浓度梯度法： 　　挑取单个菌落，用0.85%无菌盐水调整比浊至2个麦氏单位。用加样枪取20μl菌液加入ATB培养基中，充分混匀后在ATB药敏板上每孔加入135μlATB菌悬液，盖上塑料盖后注明时间和菌株记号，35℃孵育24h（注意保湿孵育）后肉眼判读结果。判读标准：与生长对照孔比较，将测试孔菌株生长抑制情况进行评分，肉眼观察清晰判为0分；轻度模糊判为1分；浊度显著减低(约抑制50％受试菌生长)判为2分；浊度轻度减低判为3分；浊度不减低判为4分。本实验中以浊度显著减低孔(2分)为MIC判断终点。 　　2．3微量肉汤稀释法： 　　按照2002年CLSI推荐的酵母菌微量稀释法抗真菌药物敏感试验参考方案［3］进行。实验菌株转种两次后，挑取单个菌落用无菌生理盐水调整比浊至0.5个麦氏单位。无菌96孔U型塑料板上一排为一组，在第一孔加入160μL的RPM1640液体培养基，其余每孔加入100μL，在第一孔加入40μL浓度为1280μg/ml的氟康唑药物贮存液并振荡混匀，然后吸取100μL到第二孔，混匀后吸取100μL到第三孔，连续倍比稀释至地十一孔，并从第十一孔吸取100μL弃去，第十二孔为不含药物的生长对照，并准备1孔进行阴性对照。此时从第一到第十一孔的药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/mL，然后在每管中加入制备好的浊度为0.5个麦氏单位的实验