数字PCR技术原理及应用-李春勇.pdfVIP

检验检测 生物技术 世界 数字PCR技术原理及应用 李春勇 (中国科学院亚热带农业生态研究所 湖南长沙 410125) 摘要:数字PCR(dPCR)是近年来引起重视并迅速发展起来的一种突破性的核酸定量分析技术。该技术先将核酸模板进行稀释,分配到大量独立 的反应单元中,使每个反应单元中只有单个模板分子,然后进行PCR扩增反应,扩增结束后对每个反应室的荧光信号进行统计学分析,来定量DNA拷贝 数。数字PCR采用先扩增后定量,因此不依赖扩增曲线的循环阈值( Ct),也无需采用内参基因和标准曲线,准确度高、重现性好,可以实现绝对定量分析。 由于其独特的技术优势,已经在临床诊断、转基因成分定量、单细胞基因表达分析、环境微生物检测和下一代测序等研究领域显示出巨大的优势和应用 前景。本文对数字PCR技术原理、定量分析方法、系统分类和应用等进行概述。 关键词:数字PCR有限稀释 泊松分布 中图分类号:R450 文献标识码:A 文章编号:1674-2060(20 14) 11-00 10-04 数字PCR(digital PCR,dPCR)是近年来引起重视并迅速发展 [2] 数字PCR的雏形。1999年Vogelstein等 在检测粪便中进行癌变组织 [1] 起来的一种突破性的定量分析技术。1992年Sykes等 检测复杂背景 脱离细胞的BRAF特异突变型基因时,因受到体细胞基因的干扰,而 下低丰度的IgH重链突变基因时,利用样品的有限稀释,让每个孔中 碰到检测灵敏度和检测分辨率的瓶颈,而采用了在384孔板中对每 只获得单个模板分子,通过计算PCR后的扩增信号,以期准确地确 个反应孔的样品量进行极限稀释并增加反应孔数进行检测的方式, 定起始分子的数量,虽然没有明确提出“数字PCR”的概念,但是已 从而提出了数字式PCR的概念,同时也提出如果采用更多孔板其检 经建立了数字PCR基本的实验流程,并且确定了数字PCR检测中一 测灵敏度会更高,从而指出了数字PCR系统的发展方向。 个极其重要的原则——以“终点信号的有或无”作为定量方法。这是 1数字PCR技术的原理 阳性反应 阳性 目标分子 阴性 阴性反应 图1数字PCR原理示意图 (a)样品,(b)样品被分成多个微小的反应单元,(c)PCR反应,(d)检测荧光计数 [10] 图2微反应室/孔板数字PCR 10 生物技术世界BIOTECHWORLD 生物技术 检验检测 世界 [11,12] 图3微流控芯片数字PCR