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利咽解毒颗粒微生物限度检查的方法验证 　　【摘 要】确认所采用的检验方法适合于利咽解毒颗粒的微生物限度检查计数检验。对3个批次的利咽解毒颗粒进行了微生物限度检查方法学验证。细菌、霉菌及酵母菌计数方法为平皿法。结果：各组实验回收率均大于70% 。结论：利咽解毒颗粒的微生物限度检查计数方法可采用平皿法。 　　【关键词】利咽解毒颗粒；平皿法；回收率 　　【中图分类号】R286 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）05-3235-02 　　利咽解毒颗粒功能主治：具有清肺利咽，解毒退热的作用；用于外感风热所致的咽痛、咽干， 喉核红肿、两腮肿痛，发热恶寒；急性扁桃体炎，急性咽炎，腮腺炎见上述证候者。 　　《中国药典》2010年版一部附录XIII C 规定当建立药品的微生物限度检查法时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌数的测定。因此，我们按中国药典2010年版一部规定的常规法对利咽解毒颗粒进行了细菌、霉菌及酵母菌数回收率的试验。 　　1 材料 　　1.1 样品 　　利咽解毒颗粒 （生产厂家：神威药业集团有限公司），批10090931 　　规格：每袋装6g（无蔗糖，相当于饮片19g）。 　　1.2 仪器设备 　　脉动真空灭菌柜 ，型号XG1.U（山东新华医疗器械股份有限公司）；生化培养箱，型号LRH-150B（广东省医疗器械厂）；电热恒温培养箱，型号GHP-9160（上海一恒科技有限公司）；电热鼓风干燥箱，型号101-2A（上海沪南科学仪器联营厂）；生物安全柜，型号BHC-1300IIA/B3（苏州安泰空气技术有限公司）。 　　1.3 培养基及试剂 　　改良马丁培养基（批号090908）、改良马丁琼脂培养基（批号 090325）、营养琼脂培养基（批号100105）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号 1003082）、营养肉汤培养基（批号091215）、曙红亚甲蓝琼脂培养基（批号 1003082）、胆盐乳糖培养基（批号1003022）、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（批号091120 ）、聚山梨酯80、司盘80、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠等。 　　1.4 验证用菌种 ： 　　金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；大肠埃希菌[CMCC（B）44 102]；枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63 501] ；黑曲霉菌 [CMCC（F）98 003]；白色念珠菌 [CMCC （F） 98 001]均购自中国药品生物制品检定所。 　　2 菌液制备方法 　　分别取经33℃培养24h的金黄色葡萄球、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌营养肉汤液体培养物1ml，加入至9ml 0.9%无菌NaCl溶液中，10倍稀释至10-5约为50～100cfu/ml的菌悬液，备用。 　　取经25℃培养48h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml，加入至9ml 0.9%无菌NaCl溶液中，10倍稀释至10-6约为50～100cfu/ml的菌悬液，备用。 　　取经25℃接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7 天，加入3～5ml 含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后用塞有脱脂棉的弯型针头注射器吸出孢子悬液，再将脱脂棉去掉，将孢子悬液移至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含孢子数50～100 cfu 的孢子悬液，备用。 　　3 供试液制备 　　取样品10g ，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇溶解制成1：10供试液。 　　4 回收率实验方法与结果 　　4.1 验证试验进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 　　在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 　　4.2 供试品对照组：取1：10的供试液，每个平皿中加1ml，共加4个平皿，2个加入营养琼脂培养基，2个加入玫瑰红钠琼脂培养基，每个平皿加入培养基约20ml，摇匀，放冷凝固。细菌置33℃培养箱中培养72小时，霉菌（酵母菌）置25℃培养120小时计数。 　　4.3 试验组：取1：