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第四章 诱变剂 第一节 物理诱变剂 第二节 化学诱变剂 第三节 生物诱变剂 6. 航天育种： 利用太空微重力、高能粒子、高真空、缺氧和交变磁场等综合物理诱变因子进行诱变和选择育种研究。 （1）对碱基的烷化作用 3.2 作用方式 （2）引起DNA双链间的交联 4. 烷化剂的性质 烷化剂的性质比较活泼，在水溶液中容易发生水解。它们大部分半衰期很短（与温度、溶液pH关系很大）。 烷化剂杀菌率低而诱变效应高；极毒！能致癌。 操作中应有防护措施，且小心谨慎！！！！避免接触身体及污染环境。 5.几种常用烷化剂 5.1 亚硝基胍（全称：1-甲基-3硝基-1-亚硝基胍 NTG） 性质： ①黄色结晶，不溶于水，见光易分解。 ②有超诱变剂之称。能使细胞发生一次或多次突变。还能使多基因并发突变。 ③诱变适合pH值为6.0。 诱变处理方法： ①菌体用缓冲液洗下制成菌悬液，离心，洗涤（浓度106～107ml-1） ②配制NTG母液：配成1mg/ml（比例：NTG丙酮溶液1ml: 缓冲液9ml）。使用时取母液0.2ml，加菌悬液1.8ml。 ③诱变处理：参考菌种和终浓度要求，将NTG加入菌悬液，保温一定时间（细菌20～60min）。 ④终止反应：用冷生理盐水稀释50倍以上。 ⑤后处理：低温离心洗涤除去药液，加无菌水悬浮并做成一定稀释度分离于平皿。或按一定浓度加后培养基于菌体沉淀物中，振荡培养1.5～2h再稀释分离。 凡接触NTG的器皿必须及时、单独处理。 5.2 甲基璜酸乙脂（又称乙基硫酸甲烷 EMS） 性质：①无色液体难溶于水，不稳定，易水解挥发。 ②最佳诱变pH:7.0~7.4 诱变处理方法: ①配制 0.5mol/L EMS母液：预冷所需器皿，取10mol/L EMS原液0.5ml 加入9.5ml pH 7.2 的磷酸缓冲液中，加盖封口。 ②制备菌悬液：培养菌体至对数期，离心洗涤，用缓冲液制成 8ml 菌悬液（107～108ml-1；孢子为106～107ml-1）。 ③ 诱变：取EMS母液 2ml 加入以上 8ml 菌悬液中（终浓度为 0.1 mol/L ；孢子为 0.2～0.5 mol/L），处理一定时间（根据预实验结果确定）。 终止反应：用 50 倍生理盐水稀释或加入2％Na2S2O3 ，多次离心洗涤。 5.3 硫酸二乙脂 （DES） 性质：无色液体，不溶于水，很不稳定。最佳诱变 pH 7.2 诱变处理方法： ① 2％母液配制：取DES原液 0.4ml 于灭菌试管中，加入少许乙醇使溶解，再加入 pH 7.2磷酸缓冲液 19.6 ml 。 ② 菌悬液制备：用同一缓冲液将菌体洗下。 ③ 诱变处理：取以上DES溶液和菌悬液等量混合一定温度下，振荡培养20～60min。 ④ 终止反应：加入生理盐水稀释，或加入2％ Na2S2O3 0.5ml终止反应。 ⑤ 后处理：将 20ml 肉汤培养基加入菌体沉淀物中，培养1.5～2h，然后稀释分离。 三、脱氨剂（亚硝酸） 1.诱变机制： 亚硝酸可直接作用于正在复制或未复制的 DNA 分子，氧化碱基中的氨基成酮基，引起转换。还可引起 DNA 双链间的交联。 2.诱变处理方法： ① 试剂配制： ② 处理过程： ③ 终止反应： ④ 后处理： 四、移码诱变剂 1. 诱变机制：与DNA结合引起碱基增加或缺失而造成突变。主要包括吖啶黄、吖啶橙、原黄素（2 , 8 –二氨基吖啶）等。 3. 诱变处理方法：先用乙醇配成一定浓度的母液，然后加入培养基中，使最后浓度为10～15 ug/ml ，混合后制成平板，将处理菌悬液接种其上，适温下培养。 2. 性质：淡黄色晶体，微溶于热水，溶于乙醇、乙醚，见光易分解。 五、 羟化剂（羟胺） 1. 诱变机制：具有特异性，专一地诱发G:C A:T的转换。 2. 诱变处理方法：将羟胺加入培养基中，使浓度为0.1～0.5％ ，然后接入菌体，适温下培养1～2h。 性质：白色晶体，溶于水，不稳定易分解，易吸潮。 六、金属盐类 七、其它 主要有氯化锂、硫酸锰等。一般作为助诱变剂与其它诱变剂复合处理。 1. 秋水仙素 2. 抗生素 八、重视化学诱变剂的操作安全 第三节 生物诱变剂 生物诱变剂 一、噬菌体 二、基因诱变剂 三、生物诱变剂的诱变方式 寡核苷酸介导诱变 思考题 试述物理诱变剂的生物学效应。 如何用紫外线进行诱变育种？ 烷化剂的诱变作用机制是什么？ 亚硝酸的诱变作用机制是什么？ * 凡能诱发生物基因发生突变且突变率远远超过自发突变率的物理因子和生物化学物质统称为诱变剂。 包括： 物理诱变剂；化学诱变剂；生物诱变剂 诱变剂 主要内容 第一节 物理诱变剂 物理诱