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均匀的设计法优化人类SMN基因PCR扩增 　　摘要：采用均匀设计法，对影响PCR的主要因素，即退火温度、引物、Taq酶、二甲基亚砜（DMSO）、模板DNA进行了优化，得到人类SMN基因的最优PCR扩增体系。结果表明，PCR扩增条件和反应体系的最优组合为：退火温度61.6 ℃、Taq酶0.26 μL、引物（10 μmol/L）3.6 μL、DMSO（100%） 2 μL、DNA 3.8 μL。 　　关键词：DNA；盐析法；均匀设计法；灰度分析；PCR扩增 　　中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）12-3031-03 　　DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.12.061 　　Optimizing the PCR Amplification of Human SMN Gene by Uniform Design Method 　　GAO Chun-yan1a，1b，LI Jun1a，1b，CAI Lu1a，1b，2 　　（1a.The Institute of Bioengineering and Technology；1b.School of Mathematics Physics and Biological Engineering， 　　Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014010， Inner Mongolia， China； 　　2.Inner Mongolia Key Laboratory of Biomass-Energy Conversion， Baotou 014010， Inner Mongolia， China） 　　Abstract： Based on uniform design method， the critical factors implicating with PCR， such as annealing temperature， primer，Taq polymerase，DMSO，DNA，were optimized respectively and PCR amplifying condition of human SMN gene was established. The results shouwed that annealing temperature 61.6 ℃，Taq polymerase 0.26 μL， primer（10 μmol/L）3.6 μL，DMSO（100%）2 μL，DNA3.8 μL were designated to the optimized combination between PCR amplifying condition and reaction system. 　　Key words： DNA； salting out method； uniform design； gray analysis； PCR amplification 　　人类SMN基因位于染色体5q13上，全长约20 kb，含9个外显子，该染色体上有两个高度同源的拷贝，端粒侧拷贝（SMN1或SMNt）和着丝粒侧拷贝（SMN2或SMNc）。SMN1和SMN2在序列上高度相似，两者之间的DNA序列仅存在5个碱基的差异，其中SMN2基因外显子7（+6C→T）的碱基置换直接影响了基因的可变剪接模式，因此对SMN基因的研究具有重大的现实意义。人类SMN基因片段为高GC含量，富含GC碱基的DNA的PCR难点在于模板DNA形成的二级结构使DNA模板比较难变性[6]；退火时引物与模板不能很好地结合，容易形成错配；延伸过程也不能很好进行，从而使扩增效率大大降低；普通的PCR扩增1.5 kb以上的长片段基因经常会遇到困难[7]。均匀设计法[8，9]将试验有关因素的各水平数均匀分散在试验范围内，使每一个试验点具有更好的代表性，减少了试验次数，而且试验结果可用计算机处理，在寻找最佳试验条件、最佳配比等方面是选择优化条件的有力工具。本研究采用均匀设计法对PCR主要因素：退火温度、引物、Taq酶、DMSO（二甲基亚砜）、DNA等5个因素进行优化试验，从而得到适合于人类基因SMN基因片段的PCR扩增条件和反应体系的获得最优组合。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 试验材料 人类外周血标本取自包头医学院第一附属医院；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物P1：5′-CGACGACAAGACCGTGAATGAAAAT GAAAGCCAAGT-3′，下游引物P2：5′-GAGGAG