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新传染病的发现与防治 主讲 宾晓农 广州医学院预防医学教研室 2003.6.16 新传染病的发现与防治 肆虐人类数千年的各类传染病，随着人类社会和 科学的进步，经济的发展，有许多传染病在一定程度 上得到了有效控制，有的甚至被消灭或即将消灭，如： 天花或脊髓灰质炎、小儿破伤风等。 但好景不长。20世纪70年代后，因种种原因的影 响，全球传染病发病率再度回升，流行、爆发事件不 断，表现为： ①一批得到控制的传染病死灰复燃—结核、霍乱、 白喉、疟疾等。 ②又发现了数十种新的、甚至危害更大的病种。 但有一些传染病，由于病原体的特性或其 他原因很难或不可能以传统方法来发现病原体。 如: 20世纪70年代中期,非甲非乙型肝炎已 被人们认识，据流调特点 又认识到，有以血液 传播为主的非甲非乙型肝炎和经消化道传播的 非甲非乙型肝炎二种。 世界各地研究人员应用传统方法一直在找 二种肝炎的病原体。因在人体中滴度很低等原 因，一直未能分离出血液传播为主的非甲非乙 型肝炎，而消化道传播的非甲非乙型肝炎又难 以体外培养。 80年代现代分子生物学理论和技术的飞跃 发展为确定病原体提供了新的策略和方法。 即：从病人标本中直接提取病原体的基因 进行体外克隆和表达，获取可能的病原因子核 酸及编码蛋白，然后进行确定其病原特异性。 美国学者Choo等首先采用这种策略研究 输血后非甲非乙型肝炎的病原体。 步骤：病人血清 黑猩猩 感染 的黑猩猩 血清 提取RNA 反 转录成cDNA 克隆到gt11表达质粒 构建cDNA表达文库 进行体外表达 用输血后非甲非乙型肝炎病人恢复期血清筛选。 结果：最终从100万个克隆子中筛选出一 个阳性克隆，并以此部分为基础，采用基因游 走技术测定了丙型肝炎病毒的全基因系列。 90年Retes 等用同样的方法克隆测定了肠 道传播的非甲非乙型肝炎病原的全基因序列， 完成了对戊型肝炎病毒的发现和确定。 HCV、HEV 发现和鉴定的策略、方法， 是传染病病原学研究中的一个里程碑，为新传 染病病原体的发现和鉴定提供了新策略和途径。 2.3发现和确定新病原体的分子生物学技术 2.3.1.免疫cDNA文库筛选法 原理：传染病人 标本 提取病 原体核酸 克隆到质粒或噬菌体载体中 构建可表达外源核酸编码的蛋白的cDNA文库 然后用病人血清抗体与cDNA文库 表达 的蛋白反应 筛选阳性克隆 对阳性 克隆子中插入的外源核酸作序列分析 采 用基因游走技术等方法克隆测定其全基因系列。 2.3.2.RDA(representational differen analysis) 技术 是一种PCR与减数杂交相结合的技术。 原理：用PCR技术 从病人组织标本 中提出基因片段（健康人体中不存在） 提外扩增及减数杂交 扩增出可能的病原 因子的基因片段 实验鉴定 以 此基因再测得全基因序列。 此法特点：要求条件高、困难多 能从小量标本中高效富集目的 基因，对未知病原体的研究是一种有效实用的 方法。 2.3.3.兼并引物PCR法(cosensus sequence based PCR) 与RDA技术不同，其原理： 需先了解所要研究的病原与其他相类似生 物的种类进化关系 据类似生物的基因序列 以较为保守的序列设计PCR引物 对 标本PCR扩增 分析扩增片段序列 以此为基础 研究可能病原体的基因结构。 此方法对于细菌及病毒性病原体较为适用 2.3.4.随机肽库筛选法 是近年发展起来的一种新生物技术——蛋 白质/多肽呈递技术。 基本原理及流程： 利用随机肽库单克隆抗体 进行相应 蛋白质的抗原