基于PCR-DGGE的重金属污染土壤微生物种群指纹分析.PDFVIP

生态环境学报 2010, 19(9): 2204-2208 Ecology and Environmental Sciences E-mail: editor@ 基于 PCR-DGGE 的重金属污染土壤微生物种群指纹分析 1 1* 1 2 2 李晔 ，孙丽娜 ，杨继松 ，杨晓波 ，曲亚军 1. 沈阳大学区域污染环境生态修复重点实验室，辽宁 沈阳 110044 ；2. 辽宁省地质勘察局，辽宁 沈阳 110044 摘要：采用变性梯度凝胶电泳（DGGE ）分析方法，研究沈阳市细河沿岸重金属污染土壤中微生物结构多样性、种群丰富度 及种群结构的动态变化规律。结果表明：直接从土壤中抽提总DNA ，对16S rRNA V3可变区序列进行扩增，DGGE指纹图谱 分析，微生物种群结构和变化规律明显，同时也表现为重金属污染程度越重，多样性指数越低；其中细河底泥重金属含量严 重超标，多样性指数最低。经方差分析，重金属污染情况与Shannon-wiener多样性指数呈负相关，其中重金属污染对微生物 的均匀度指数影响最显著，并且锌污染对其影响最大为-0.985。表明PCR-DGGE技术可以用于污染环境下微生物多样性研究， 也为污染环境下土壤微生物多样性研究提供了新的实验方法与依据。 关键词：细河；变性梯度凝胶电泳；微生物；多样性 中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1674-5906 （2010 ）09-2204-05 土壤微生物群落结构是土壤生态功能的基础， 将细河流域自上而下，分别在其上、中、下游河段 传统方法只能揭示部分土壤微生物的特征，自然界 的富官(I) ，彰驿(II) ，土台(III)布设3 条横切细河的 中很多微生物不能用现有的培养方法进行分离和 断面上取样，取农田表层土壤(0~20 cm) ，根据每个 鉴定或是不能培养[1] ，且这种分离培养方法不能很 样点的地块形状，采取多点取样，每5 个点合为一 好地反映土壤微生物多样性的原始状态等[2] ，这就 个土壤样品。土样带回实验室，一部分土样立刻放 使得采用新的技术和方法显得尤为必要。近年来， 入-20 ℃冰冻箱中保存备用。另一部分经风干、混 随着分子生物学的发展，给微生物的鉴定和新微生 匀后，用四分法留取 1 kg，再取少量过0.149 mm 物的发现带来了很大的契机。分子生物学方法如 筛，供重金属分析测试用。 PCR-DGGE[3] ，PCR-SSCP[4]和 PCR-RFLPE[5]使得 1.2 土壤的基本理化性质及重金属含量的测定[7] 研究者能够在分子水平上对土壤微生物多样性进 土壤样品中 Hg 、Cd、Zn 、Pb 和Bi 总量的分 行研究。在分析微生物种群多样性和结构变化规律 析均参照《土壤元素的近代分析方法》进行测试。 上具有其独特的优越性[6] ，可以避开传统培养方法 土样经硝酸－硫酸－五氧化二钒消解后，冷原子吸 的局限性，大大丰富对土壤微生物结构多样性的分 收法测定 Hg ；土样经盐酸－硝酸－氢氟酸－高氯 析。因此，本研究从沈阳市细河沿岸不同河段采集 酸消解后，石墨炉原子吸收分光光度法测定 Cd 和 土壤样品，对其重金属含量进行测定，并直接从土 Pb ，火焰原子吸收分光光度法测定Zn 。土壤样品中 壤中提取宏基因组 DNA ，基于 16SrRNA 的 Bi 总量的分析经盐酸－硝酸消解后，采用原子荧光 PCR-DGGE 指纹图谱分析，来全面综合地反映重金 分光光度法测定。重金属的分析测试过程中，均用 属污染对土壤微生物结构多样性所产生的影响，以 GSS －3 标准参考土壤进行全程质量控制。 [8] 明确受重金属污染土壤中微生物结构的变化规律