chapter 7 糖组学.ppt

1、糖组学(glycomics) 的背景及研究意义 20 世纪末,继基因组学、蛋白质组学之后,糖组学也日益受到人们关注。顾名思义,糖组学是对糖链组成及其功能研究的一门新学科,是基因组学的后续和延伸,具体内容包括研究糖与糖之间、糖与蛋白质之间、糖与核酸之间的联系和相互作用,其主要研究对象为聚糖。丰富多样的聚糖覆盖了生物有机体的所有细胞,不仅体现细胞的类型和状态,也参与了许多生物学行为,如细胞发育、分化、肿瘤转移、微生物感染、免疫反应等;聚糖还体现生物和分子的进化作用,如糖酵解、生物合成的保守性以及核糖的起源等。 总 之 毫无疑问,如果试图深入了解生命的复杂规律,就必须有“基因组－蛋白质组－糖组”的整体观念,这样才有可能揭示自身全部基因功能,从而进一步深入研究疾病的发病机制,有效控制疾病的发生、发展及预后,以及筛选疾病、预测诊断标记物和开发新的药物靶标。 2、糖组学的研究策略 糖组学的研究远较基因组学、蛋白质组学复杂。 目前糖组学关注的焦点是糖蛋白,为了更好地与蛋白质组学相关联,将研究对象锁定为糖肽。研究核心策略为: (1) 分析单物种生物所产生的所有聚糖; (2) 以糖肽为研究对象确认编码糖蛋白的基因; (3) 结合有效的理化和生化性质,研究糖蛋白糖链的性质。 研究的重点在于: (1) 编码糖蛋白的基因; (2) 实际糖基化的位点; (3) 聚糖结构; (4) 糖基化的作用。 主要分为三大部分: 结构糖组学、功能糖组学以及生物信息学;其中结构糖组学主要包括“糖捕获”技术、前沿亲和层析技术等,功能糖组学主要包括微阵列技术等。 3、糖组学研究技术进展 1）结构糖组学 根据与糖链连接方式不同,蛋白质主要有N－连接和O－连接两种糖基化形式: 前者是糖链与蛋白Asn－XXX－Ser/Thr 序列子(XXX 为除脯氨酸以外的氨基酸) 中Asn 残基上的 —NH2 相连;后者则是糖链与蛋白Ser/Thr 残基上的—OH 相连。N－连接和O－连接糖蛋白主要定位于细胞膜表面,也可以分泌型蛋白的形式存在。此外,糖蛋白还有GPI锚定蛋白和近年来在细胞核和细胞质发现的O－GlcNAc（N-乙酰氨基葡萄糖 ）修饰蛋白两种存在形式。 小 结 糖链结构信息包括糖链的单糖组成、异头碳构型、糖苷键的连接位置和糖残基的序列分析等内容。糖蛋白糖链的结构分析包括糖蛋白的提取分离、糖链释放和糖链结构鉴定等多个步骤。 （1）糖蛋白的提取和分离纯化 糖蛋白多定位于细胞表面,属于膜蛋白,水溶性不好,其有效提取是糖组学糖链结构研究的瓶颈之一。目前常采用先制备质膜,然后用CHAPS 等去污剂释放或Triton X－114 相分离、有机溶剂萃取等方法提取糖蛋白。获得的糖蛋白主要采用透析、超滤、电泳和层析等方法来分离纯化,其中由几种不同类型凝集素亲合柱组成的序列凝集素亲合层析(serial lectin affinity chromatography, SLAC) 法是较好的方法。 ●SLAC 研究发现，植物凝集素是一类能选择性地结合糖链的糖结合蛋白。利用这种特性可以特异性地富集某种糖蛋白/糖链。用于纯化糖蛋白/糖链的植物凝集素主要有刀豆凝集素(concanavalin A, Con A)、麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)、豌豆外源凝集素(pea lectin)、植物血凝素(phytohaemagglutinin-E4 ,E4-PHA) 和网孢盘菌凝集素(Aleuria aurantia lectin,AAL)等。单一一种凝集素并不能够富集细胞中所有的糖蛋白/糖链，因此科学家们在上世纪80年代发明了一种被称作连续凝集素亲和色谱(serial lectin affinitychromatography, SLAC)的方法来分离同一细胞中的各种糖蛋白/糖链。这种方法是将不同的凝集素亲和柱串联排列，样品混合物依次经过这些亲和柱，这样就可将不同的糖蛋白/糖链富集在不同的柱中，提高了糖蛋白/糖链的回收效率和混合糖蛋白/糖链的分离效果。 The lectins tested recognize the following residues: β-D-galactosyl [Ricinus communis agglutinin 120, (RCA-1) and peanut agglutinin, (PNA)]; α-D-galactosyl [Griffonia simplicifolia agglutinin (GSA)]; α-D-mannosylα-D- glucosyl [concanavalin A (ConA) and Lens culinaris agglutinin (LcH)]; N-acetyl- and N-gl