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步骤： 首先用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板 DNA ， 再将酶切后的 DNA 片段连接成环状分子， 最后根据已知片段两端的序列设计引物， PCR扩增邻近的DNA 片段。 3) .利用接头的PCR 步骤： (1)基因组DNA的限制性内切酶酶切， （2）接头与限制性内切酶片段的连接， （3）已知序列侧翼未知序列的PCR扩增（利用分别根据已知序列和接头序列设计的引物）。 4).（1）热不对称交错PCR TAIL-PCR的基本原理： 利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物（简称sp1，sp2，sp3），用它们分别和1个具有低Tm值的短的随机简并引物（arbitrary degenerate prime，AD，约14bp）相组合，根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环，通过分级反应来扩增特异引物。 第一次反应包括5次高特异性、1次低特异、10次较低特异性反应和12个热不对称的超级循环。5次高特异性反应，使sp1与已知的序列退火并延伸，增加了目标序列的浓度；1次低特异性的反应使简并引物结合到较多的目标序列上；10次较低特异性反应使2种引物均与模板退火，随后进行12次超级循环。 第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。 第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环， 通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 sp1，sp2，sp3 随机引物 高浓度引物 低浓度引物 （2）不对称PCR 3.与反转录相关的PCR扩增 RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR， 可对基因的表达和序列多态性分析。 ＲＴ－ＰＣＲ ＤＮＡ聚合酶 cDNA PCR扩增 AAAnA AAAnA 逆转录酶 反转录 T T TnT cDNA第一链 mRNA 1）cDNA末端的快速扩增（rapid amplification of cDNA end,RACE) (a) 5’RACE： GSP3 设计引物，合成cDNA第一链 AAAAA…..AAAAn Poly(A)尾 TTTTT …..TTTT 5’ AP AAAAA…..AAAAn TTTTT …..TTTT 5’ 用RNase降解模板mRNA,纯化cDNA第一链 TTTTT …..TTTT 5’ -------------------------------------- --------------------------------------- --------------------------------------- TTTTT …..TTTT GSP1 AUAP GSP2 (b) 3’RACE 特异性引物与接头引物对cDNA的PCR扩增 2)差异显示PCR: (Differential display reverse transcriptase-PCR,DDRT-PCR) 使用3’端的锚定引物（T12MN），通过反转录过程，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上，分成大致相等但序列结构不同的12亚份群体，这一过程叫差异显示反转录(DDRT). 锚定引物的通式是oligo(dT)12MN，M：A、C、G；N：A、C、G、T共有12种oligo(dT)12MN引物。 4.PCR产生DNA指纹 1）多重PCR(multiplex PCR)： 设计多对引物，在同一个PCR反应体系中，同时扩增一份DNA样本中几个不同靶区域的DNA片断，这一过程称之为多重PCR. 使用随机选择的核苷酸作为PCR反应体系中的引物，在较低的复性温度下(36℃)进行PCR。由于非特异性引物与模板上的多个位点结合而不是与某一限制性位点特异性结合，因此经过PCR扩增反应后可以产生多个PCR产物。经凝胶电泳可以将上述多个PCR反应产物分离，这样多态性的产物通常称为随机扩增多态性DNA(random ampification polymorphic DNA,RAPD) 2）随机扩增多态性（random ampification polymorphic DNA,RAPD ） 是针对基因组DNA的限制性酶切片断进行选择性PCR扩增而建立DNA指纹的技术。 1）基因组DNA的限制性内切酶酶切， 2）（与酶切片段末端相对应的）接头与酶切DNA片段的连接， 3）（含有接头序列和酶切位点序列及延伸序列的）引物对连接产物作PCR扩增。 3）扩增片断长度多态