基因诊断- 肿瘤的分子诊断教程教案.ppt

;一、基因诊断概述;(一)基因诊断的概念与特点;2．基因诊断的特点：;基因诊断的评价;(二)基因诊断的基本原理与临床意义 ;二、基因诊断的常用技术与方法;(一)基因诊断常用技术;基因诊断技术分类;1. 核酸分子杂交Molecular hybridization;核酸杂交的基本原理：;核酸分子杂交的流程示意图;探针的种类; 不同的探针在应用中有各自的特点,但最重要的是探针的序列选择.而探针序列又是依据待测核酸序列选择的。 　　对致病性微生物应选用其最保守、最特异的序列；对突变基因的检测，应用含有突变位点的序列或待测基因编码的ｍＲＮＡ序列。;探针的标记物;Southern blot;1、Southern blot：用于DNA检测，不但能检测出特异的DNA片段，还能进行定位和测定分子量，可用于基因的限制性内切酶图谱分析、基因突变分析等。 2、Northern blot：杂交用于RNA检测，能对组织细胞中的总RNA或mRNA进行定性和定量分析。 3、dot blot：既可检测DNA也或检测RNA，用于基因组中特定基因及其表达的定性和定量分析。缺点：特异性较低，不能鉴定所分析的基因分子量。 4、原位杂交：在组织、细胞和染色体水平作核酸定性和定量分析，并可定位。;PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程;PCR技术的优点;;2、采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析 （PCR－RFLP）;3、采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针杂交技术; PCR/ASO则是采用PCR扩增受检者基因的目标片段，并与相应的ASO探针杂交，如果受检者DNA扩增的产物与正常探针杂交，而不与突变探针杂交，表示受检者不存在突变基因；如果只有突变探针可以杂交，说明突变基因为纯合子；如果两者都存在，则说明突变基因为杂合子。; βΑ/βΑ βΑ/βS βS/βS 正常探针 突变探针;4、PCR产物的反相点杂交分析技术; 单链构象多态性（SSCP）分析是一种基于单链DNA构象差别来检测点突变的方法。DNA经变性形成单链后，在中性条件下单链DNA会因其分子内碱基之间的相互作用，形成一定的立体构象。相同长度的单链DNA会因分子内碱基组成或排列顺序不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。对长度相同而构象不同的单链DNA在非变性聚丙烯胺凝胶电泳中表现出不同的迁移率。 ; PCR-SSCP技术就是利用PCR扩增目的基因片段，通过变性成为单链，然后进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，单个核苷酸的改变会造成DNA片段构象的改变，其迁移率也会改变，从而检测基因的突变。;; 该技术是先制备浓度从低到高的变性剂的凝胶，然后将待测分析的PCR扩增产物进行电泳，到DNA电泳到变性剂浓度能使DNA发生变性的位置时，DNA双链分开，由于不同DNA片段的碱基组成不同，因此在凝胶中泳动发生变性的位置不同，迁移率也不同，因此可以将相同长度但碱基组成不同的DNA片段分开，从而能检测出基因的突变。; DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用，是目前新的研究热点之一。 如在一般正常的细胞中，基因调控区CPG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些区域往往呈现甲基化状态。因此DNA甲基化研究是一热点。; 将DNA先用亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。在MS-PCR中设计两对引物，一对为甲基化特异性的引物（primerⅠ），一对为非甲基化的引物（primerⅡ），进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物，最终可以确定研究DNA片段部位的甲基化情况。;以上介绍的基于PCR扩增技术建立的基因诊断技术，只能提供定性结果，即有无突变。但对基因表达异常的疾病，上述方法无法满足需要，还需要研究其基因的表达量上的变化分析，故还可运用PCR定量分析基因表达。 PCR定量分析方法有：梯度（系列）稀释法、极限稀释法、非竞争性对照法、竞争抑制法 、 荧光定量PCR;;梯度（系列）稀释法：;首先将原始模板进行梯度稀释; 然后对该稀释系列进行PCR扩增测定; 最低的阳性样本被认为含有与一已知的标准稀释系列中最后的阳性样本中相同量的PCR