8生物分离(程)技术(第八章凝胶色谱技术).pptVIP

* * 3、凝胶装柱。 ①将层析柱垂直装载支架上，将下端输液管夹紧； ②向柱中加入约1/3体积的0.9％NaCl溶液； ③将一细玻棒伸入柱内，靠近管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内加入混匀的凝胶溶液； ④凝胶加至层析柱顶端约3cm时，打开柱下端输液开关，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。 ④连续而缓慢的加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。 （防止空气进入凝胶床） 4、样品上柱及洗脱 ①加样量的控制 　　　分析：1-2ml/100ml床体积， 　　　制备：10-30ml/100ml床体积 ②洗脱液的选择：洗脱液应与浸泡凝胶时所用的溶液一致，否则由于更换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响分离效果。 ③凝胶层析加样操作示意图 ④洗脱与自动收集记录 ⑤凝胶柱层析实物连接 ⑥凝胶层析中的分离行为 凝胶层析加样操作示意图 1、平衡好的层析柱。 2、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起。 3-4、打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液， 5-7、当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。 8-9、最后加入3—4mL洗脱液于凝胶上。 10、连接柱层析系统，自动收集记录。 洗脱与自动收集记录 凝胶柱层析实物连接 凝胶层析中的分离行为蓝葡聚糖（兰色）、血红蛋白（红色）、铬酸钾(黄色) 5、Vo、Vi、Vt的测定 ①Vo的测定 选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱峰峰顶洗出的体积（Veo）就是该柱的Vo值。 ②Vi的测定 选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其洗脱体积Vei，减去Vo就是该柱的Vi 。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定Vi。 ③Vt的测定 式中，π为常数3.14，D为柱直径，h为凝胶床的高度。 6、标准曲线的制作及Kd和Kav的计算 按操作技术4的方法，将1mL标准蛋白质混合液上柱，然后用0.025mol／L氯化钾-0.2mol／L乙酸溶液洗脱。流速3mL／10min，3mL／管。用核酸蛋白质检测仪280nm处检测，用部分收集器收集，记录洗脱曲线，或收集后用紫外分光光度计于280nm处测定每管光吸收值。 以管号(或洗脱体积)为横坐标，光吸收值为纵坐标作出洗脱曲线。 根据洗脱峰位置，量出每种蛋白质的洗脱体积(Ve) ，以蛋白质分子量的对数1gMr，为纵坐标，Ve为横坐标，作出标准曲线。 根据已测出的Vo和Vi以及Vt，分别求出Kd和Kav 7、未知样品分子量的测定 完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积，重复测定1-2次，取其平均值。也可以计算出Kav分别由标准曲线查得样品的分子量。 8、凝胶柱的保养和凝胶的保存 凝胶的保存可采用以下两种方法： （1）经常使用的凝胶以湿态保存为宜，加入适当的抑菌剂。常用的抑菌剂:0.02％叠氮钠 (2)较长时期不使用的凝胶可采用干燥保存法。 依次用70％、90％和95％乙醇逐步脱水，使凝胶皱缩，最后用乙醚洗涤干燥或在60-80℃下烘干。 第五节 凝胶层析的应用 脱盐和浓缩 分离生命物质 测定分子量 思考题 ①凝胶过滤分离大分子物质的机理是什么？分子量为8万和10万的蛋白质能否在Sephadex G-75柱中分开？为什么？ ②概述哪些因子影响凝胶过滤的分辨率？为什么？ ③在4×60cm和1×60cm；1×40cm和1×80cm两组交两组交联葡聚糖G-100柱中，当每cm2截面积上流速和分级收集体积一致时，问两组柱中那一种分辨率高？为什么？ ④在凝胶层析柱中分离某有效成分时，洗脱体积为140ml,其外水体积和总体积分别为60和200ml，求分配系数是多少？ ⑤在5.0×60cm的凝胶柱中脱盐时，就理论值而言，最多加样体积是多少毫升？ 稍息 * * * * * * * * * * * * * * * (8)操作压的增加会影响流速变慢，此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床容积的改变，相应测出的Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。 * ( * * * 生物分离(工程)技术 生物分离（工程）技术 主讲：吴元喜 E-mail: wuyuanxi@mail.hust.edu.cn 联系电话：0272010年8月 生物工业下游技术一般工艺过程 第八章 凝胶层析法 第一节凝胶的