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基因選殖的策略 原核生物-細菌 萃取chromosome DNA Partial digestion DNA(選一種限制酶) Vector (去磷酸根)(降低self-ligation) Ligation, trnasformation 藍白篩選 活性篩選 真核生物? 選殖基因的定序 Clone確認 定序primer的選擇 Vector上的forward reverse序列 Ex: pUC18 第二次定序自行設計primer 序列的組合(正股 反股) 定序完成後的工作 上網比對序列blast確認所clone的基因 預測ORF (open reading frame) DNA-STAR VECTOR NTI 9.0 ORF的確認 Ribosome binding site (RBS -6 ~ -12 GA rich) 蛋白的分子量與基因長度相關性 TATA box (-35 -10) 設計primers subclone, expression Expression vector 的選擇(pET, pQE, pGEX4T…) 基因產物的純化 設計Primers PCR基因產物前的分析工作 解讀限制酶圖譜 Primer序列加上限制酶切位 選擇哪種限制酶切位 Multi-cloning site有的切位 轉錄或轉譯起始位置的考量(與載體有關) primer設計時要注意序列