产黄青霉阿魏酸酯酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达-食品科学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 A Thesis Submitted for the Application of the Master’s Degree of Engineering Cloning and expressing the fae gene of Penicillium chrysogenum in Pichia pastoris Candidate: Hongyu Hu Specialty: Food Science Supervisor: Professor Yunhua Hou Qilu University, Jinan, China June, 2014 万方数据 万方数据 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属齐鲁工业 大学。齐鲁工业大学享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利 等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，本 人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单 位仍然为齐鲁工业大学。 论文作者签名： 日期： 年 月 日 导 师 签 名： 日期： 年 月 日 齐鲁工业大学硕士学位论文 齐鲁工业大学硕士学位论文 目录 目录 万方数据 万方数据 万方数据 万方数据 目 录 摘 要 I ABSTRACT I 第 1 章 绪论 1 1.1 阿魏酸 1 1.2 阿魏酸酯酶 2 1.3 阿魏酸酯酶的来源 2 1.4 阿魏酸酯酶的分类及特性 4 1.5 阿魏酸酯酶的结构及催化特性 5 1.6 微生物来源的阿魏酸酯酶（FAEs）蛋白定向改造 6 1.6.1 在制浆造纸行业方面的应用 6 1.6.2 在食品行业方面的应用 7 1.6.3 在生物能源方面的应用 7 1.6.4 在动物养殖业方面的应用 8 1.6.5 在合成方面的应用 8 1.7 阿魏酸酯酶的表达宿主类别 9 1.7.1 在植物细胞中表达外源的阿魏酸酯酶基因 9 1.7.2 细菌 9 1.7.3 真菌 9 1.8 产黄青霉 10 1.9 本论文的研究意义和内容 10 1.9.1 研究意义 10 1.9.2 研究内容 11 第 2 章 产黄青霉 HA4089 阿魏酸酯酶 A 基因的克隆 13 2.1 试验材料 13 2.1.1 菌株与质粒 13 2.1.2 培养基及相关溶液配制 13 2.1.3 工具酶和试剂 14 2.1.4 主要仪器 14 2.2 试验方法 14 1 2.2.1 产黄青霉 HA4089 染色体 DNA 的提取 14 2.2.2 产黄青霉 HA4089 阿魏酸酯酶 A 基因的引物设计 15 2.2.3 阿魏酸酯酶 A 的扩增 15 2.2.4 产黄青霉 faeA 的 PCR 产物回收 16 2.2.5 阿魏酸酯酶 A 的 PCR 产物亚克隆及大肠杆菌转化 16 2.2.6 阿魏酸酯酶 A 外显子 1 和 2 的基因扩增及产物回收 18 2.2.7 重叠拼接 PCR 技术克隆 HA4089 阿魏酸酯酶 A cDNA 基因 18 2.2.8 毕赤酵母表达载体 pPIC9K-PcfaeA 的构建 18 2.3 试验结果与分析 20 2.3.1 产黄青霉基因组的提取 20 2.3.2 产黄青霉 HA4089 阿魏酸酯酶 A 基因的克隆 21 2.3.3 产黄青霉阿魏酸酯酶 A 外显子 1 和外显子 2 基因的扩增 23 2.3.4 阿魏酸酯酶 A 外显子 1 和外显子 2 的重叠拼接 PCR 23 2.3.5 表达载体 pPIC9K-PcfaeA 的构建 23 2.3.6 阿魏酸酯酶 A cDNA 基因与蛋白序列分析 25 2.4 本章小结 29 第 3 章 产黄青霉 HA4089 阿魏酸酯酶 A 基因在毕赤酵母中的表达31 HYPERLINK \l _TOC_250000 3.1 试验材料 31 3.1.1 菌株 31 3.1.2 培养基及相关溶液 31 3.1.3 限制性内切酶 32 3.1.4 主要仪器 32 3.2 试验方法 32 3.2.1 表达载体 pPIC9K-PcfaeA 的线性化 32 3.2.2 毕赤酵母感受态细