多聚乳糖胺型N-聚糖与结肠癌细胞株SW620耐药性的关系探讨-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

多聚乳糖胺型 多聚乳糖胺型 N-聚糖与结肠癌细胞株 SW620 耐药性的关系探讨 中文摘要 I I PAGE IV PAGE IV 中文摘要 目的 5-氟尿嘧啶(5-FU)是临床治疗结肠癌的最常用药物之一。本文在 5-FU 处理结 肠癌细胞 SW620 后，分析多聚乳糖胺链的表达水平变化；并检测合成多聚乳糖胺 链的糖基转移酶β3GnT8 基因和蛋白水平的表达变化。同时为了进一步阐明多聚乳 糖胺链及糖基转移酶β3GnT8 与结肠癌细胞 5-FU 耐药性的相关性，以耐药细胞株 SW620/5-FU 为研究对象，检测耐药细胞株中多聚乳糖胺链和糖基转移酶β3GnT8 的表达水平，初步探讨多聚乳糖胺链及糖基转移酶β3GnT8 与结肠癌细胞耐药性的 关系。 方法 (1)MTT 药物敏感实验来测定 5-FU 处理 SW620 细胞后细胞的半数致死率 (IC50)；Hochest 33258 试剂盒和流式细胞术检测 5-FU 处理 SW620 细胞后细胞凋 亡程度变化；流式细胞术检测 5-FU 处理 SW620 细胞后细胞周期变化；流式细胞 术和 Lectin-blot 分别检测 5-FU 处理 SW620 细胞后细胞表面及细胞内多聚乳糖胺 链的表达变化；碱性磷酸酶试剂盒 ALP/AKP 检测 5-FU 处理 SW620 细胞后细胞分 化指标碱性磷酸酶(ALP/AKP)的活性变化；Western-blot 检测糖基转移酶β3GnT8 和 CD147 在蛋白水平的表达情况。 (2)利用逐步递增浓度间歇作用法筛选耐药细胞株 SW620/5-FU；MTT 药物敏 感实验测定耐药细胞株 SW620/5-FU 的耐药指数；Real-time PCR 检测耐药相关蛋 白 P- 糖 蛋 白 (P-gp) 基 因 的 mRNA 水 平 表 达 ； Western-blot 检 测 耐 药 细 胞 株 SW620/5-FU 和 SW620 中肿瘤干细胞标志物 CD133 蛋白表达；Hoechst 33258 试 剂盒和流式细胞术检测两株细胞的凋亡情况；Real-time PCR 和 Western-blot 分别 检测耐药细胞株 SW620/5-FU 及 SW620 中β3GnT8 的 mRNA 和蛋白水平表达；流 式细胞术和 Lectin-blot 分别检测两株细胞的细胞表面和细胞内多聚乳糖胺的表达。 中文摘要 多聚乳糖胺型 N-聚糖与结肠癌细胞株 SW620 耐药性的关系探讨 结果 (1)5-FU 处理 SW620 细胞后，细胞的凋亡程度升高，细胞周期主要抑制在 S 期，细胞表面及细胞内全部多聚乳糖胺链的表达均降低，且有时间依赖性，细胞 分化程度升高； 5-FU 处理 SW620 细胞后，Western-blot 检测β3GnT8 和 CD147 的蛋白水平表达变化，结果表明两者表达均有显著增加。 (2)筛选得到耐药细胞株 SW620/5-FU，耐药指数 RI 为 7.62。其 P-gp 基因 mRNA 表达水平明显高于 SW620 细胞；两种细胞中肿瘤干细胞标志物 CD133 蛋白水平表 达变化不大，无统计学意义；SW620 细胞凋亡水平高于 SW620/5-FU 细胞；以上 结果均表明耐药细胞株筛选成功。β3GnT8 的基因和蛋白水平表达在两株细胞中差 异显著 ，其在 SW620/5-FU 细胞中 表达明显 高于 SW620 细胞； 流式细胞 术 和 Lectin-blot 检测两种细胞中细胞表面和细胞内的多聚乳糖胺链的表达，结果显示多 聚乳糖胺链在 SW620/5-FU 细胞中表达水平明显高于 SW620 细胞。 结论 (1)5-FU 能够促进 SW620 细胞的凋亡，将细胞周期主要抑制在 S 期；5-FU 能 够抑制多聚乳糖胺链的表达，同时也抑制了糖基转移酶β3GnT8 和细胞表面糖蛋白 CD147 的蛋白水平表达。推测 5-FU 处理 SW620 细胞后，因其抑制了β3GnT8 的蛋 白表达而影响多聚乳糖胺链的合成，细胞凋亡水平也进而增强，同时降低了 CD147 的表达。 (2)筛选得到的 5-FU 耐药细胞株 SW620/5-FU 高表达 P-gp，SW620/5-FU 细胞 表面及细胞内多聚乳糖胺链表达水平均高于 SW620 细胞，β3GnT8 基因和蛋白水 平表达也高于 SW620 细胞，而细胞凋亡水平低于后者。两细胞凋亡程度不同及多 聚乳糖胺链表达差异的原因可能是由于合成多聚乳糖胺链的糖基转移酶β3GnT8 的表达变化引起，进而推测β3GnT8 可能促进肿瘤细胞产生耐药性。 关键词：5-FU；多聚乳糖胺链；β3GnT8；结肠癌；耐药性 作 者：高利平 指导老师：周迎会 多聚乳糖胺型 多聚乳糖胺型 N-聚糖与结肠癌细胞株 SW62