特殊生物显微镜原理和使用.ppt

特殊生物显微镜的原理与使用 兰州大学细胞生物学研究所 主要内容 暗视野显微镜 相差显微镜 偏光显微镜 微分干涉显微镜 荧光显微镜 激光共焦扫描显微镜 1 暗视野显微镜 根据丁达尔效应原理设计的一种在黑色背景条件下观察被检物体的显微镜 观察到明场看不到的极其微小的物体 最高分辨率可达0.004微米 1.1 原理 丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒发光。 暗视野显微镜就是利用微粒发光原理设计的。 1.2 结构特点 使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。 暗场显微镜原理 1.3成像特点及优缺点 在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。 一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。 1.4 应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。 1.5 暗场显微镜的要求 要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘 物镜前透镜必须清洁无尘 载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求 1.6暗场观察方式调节 (1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。 (2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。 (3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。 2 相差显微镜 2.1 原理 光波有振幅（亮度）、波长（颜色）及相位(指在某一时间上光的波动所能达到的位置)的不同。 当光通过物体时，如波长和振幅发生变化，人们的眼睛才能观察到，这就是普通显微镜下能够观察到染色标本的道理。而活细胞和未经染色的生物标本，因细胞各部微细结构的折射率和厚度略有不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅相位有变化(相应发生的差异即相位差)，而这种微小的变化，人眼是无法加以鉴别的，故在普通显微镜下难以观察到。 相差显微镜能够改变直射光或衍射光的相位，并且利用光的衍射和干涉现象，把相位差变成振幅差(明暗差)，同时它还吸收部分直射光线，以增大其明暗的反差。因此可用以观察活细胞或未染色标本。 2.2结构特点 相差显微镜与普通显微镜的主要不同之处是：用环状光阑代替可变光阑，用带相位板的物镜(通常标有PH的标记)代替普通物镜，并带有一个合轴调节用的望远镜。 环状光阑是由大小不同的环状孔形成的光阑，它们的直径和孔宽是与不同的物镜相匹配的。 相位板安装在物镜的后焦面处，相板装有吸收光线的吸收膜和推迟相位的相位膜。它除能推迟直射光线或衍射光的相位以外，还有吸收光使亮度发生变化的作用。 调轴望远镜是用来进行合铀调节的。相差显微镜在使用时，聚光镜下面环状光阑的中心与物镜光轴要完全在一直线上，必需调节光阑的亮环和相板的环状圈重合（共轭重合），才能发挥相差显微镜的效能。否则直射光或衍射光的光路紊乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能推迟，就失去了相差显微镜的作用。 2.3使用方法 （1）相差装置的调换安装 卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿色滤光片放在上面，它可吸收红色和蓝色光，使波长范围小的单色光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。 （2）调焦 打开光源，旋转集光器转盘，将“0”对准标示孔，使普通聚光器部分进入光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操作方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的直径和孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40X时应用40X标示孔的光阑。 （3）合铀调整 拔出目镜，插入合铀望远镜，一边从望远镜向内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动望远镜内筒使其上升，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的暗环，此时可将望远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与暗环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合。 （4）观察