活性芽孢杆菌分离鉴定.pptVIP

活性芽孢杆菌的分离、鉴定与育种 闫恒 黄瑞辉 段花蕊 引言 芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收。芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等 而淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。现在淀粉酶主要来源于植物和微生物并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产生菌是淀粉酶生产的头等大事。 本实验从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株 实验目的 掌握如何设计分离生物活性菌株的实验方案; 掌握诱变育种各方法的基本原理和操作; 掌握原核微生物多相分类的总体方法及表型、基因型和 系统发育分析的主要技术: 掌握微生物菌种的冷冻干燥保藏和液氮超低温保藏的原 理和方法。 了解活性菌株产物测定(淀粉酶活性，纤维素酶活性， 蛋白酶活性) 的相关方法及其原理(测定方法，仪器 的使用) 实验材料与仪器 1、实验材料：河北大学生科楼院前土壤 2、仪器设备：高压蒸汽灭菌锅、培养皿、培养基分装器、PH试纸、移液管、吸耳球、玻璃棒、量筒、三角刮、试管、试管架、酒精灯、电子天平、显微镜、三角烧瓶、洗瓶、接种针、接种环、双层瓶、擦镜纸、德汉氏小管、直尺、记号笔等。 诱变箱：微波炉（E30E-3） 离心机、721分光光度计； 3、培养基和试剂： （1）培养基：淀粉培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、种子培养基、糖发酵培养基、明胶培养基、柠檬酸盐培养基、醋酸铅培养基、蛋白胨液体培养基（吲哚实验）、葡萄糖蛋白胨培养基（V.P.、M．R实验）、硝酸盐液体培养基、酪素培养基 （2）试剂：碘液、孔雀绿染液、番红染液、乙醚、吲哚试剂、KOH、α-耐酚、甲基红、格里斯氏试剂、锌粉、3%H2O2 、柠檬酸缓冲液、1%淀粉溶液、3,5-二硝基水杨酸 实验流程 活性菌株的分离筛选 诱变育种 高产菌株发酵条件优化 活性菌株的鉴定 菌种保藏 一、活性菌株的分离筛选 1.原理： 目前，土壤芽孢杆菌分离方法主要有两种，一种是根据在平板上所生长的菌落，鉴定出芽孢杆菌，该方法主要问题是由于微生物种群繁多，会影响分离结果；另一种是先加热以杀死非芽孢细菌，再根据菌落特征，分离出芽孢杆菌，该方法简单易行，是目前常用的方法，筛选一些特殊芽孢杆菌时多用此方法。 用于分离芽孢杆菌的培养基有多种，最常用的有牛肉膏蛋白胨琼脂和麦芽汁牛肉膏蛋白胨琼脂，其中麦芽汁培养基分离得到的菌落直观、分散，易于计数，可作为基础培养基。产淀粉酶的活性芽孢杆菌常使用淀粉培养基进行分离，在平板上滴加碘液，可产生淀粉酶的菌株水解淀粉遇碘不变蓝，在培养基表面形成透明圈。淀粉培养基作为筛选培养基。 测定淀粉酶的活性可以把待测菌株种在淀粉培养基表面，经培养后测定透明圈与菌落直径的比值（H/C值）大小来衡量淀粉酶活力高低。 初筛是指从大量的菌落中随机挑取进行摇瓶试验并通过检测得到一些较优菌株；复筛是指将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株。 一、活性菌株的分离筛选 实验步骤：采集土样, 称取 5 g土样, 放入装有 45mL无菌水的三角瓶中, 震 荡 20m in后静置 5m in , 然后进行浓度梯度稀释到10-4、10-5、10-6 把10-4、10-5、10-6分别涂布到淀粉培养基上，37℃倒置、过夜培养，影印，将碘液加到淀粉平板上，记录出现水解圈的单菌落的d0 /d1 (d0 为水解圈直径, d1 为菌落直径 )。将出现水解圈的菌落进行芽孢染色，显微观察菌种形态。挑选有明显透明圈的单菌落, 制成斜面。 复筛: 将初筛得到的较优菌株再进行多次摇瓶实验验证其效价和传代稳定性，并从中得到一两个或少数几个最优的菌株 二、紫外诱变 诱变育种: 即用人工诱变的方法诱发微生物基因突变，通过筛选，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性能优良的突变体。 1.原理：紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。 紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。紫外线对微生物有诱变作用，主要引起是DNA的分子结构