层析介质寿命与层析介质清洗验证.pdf

层析介质的寿命与层析介质的清洗验证 前言 在近 20-30 年生物技术在中国得到了迅猛的发展。随着生物 制药技术的 发展，生物药物的质量越来越得到重视。生物药 物从研究到上市，其过程包 括，实验室成果转化到临床试验，最终由患者广泛应用。药物研发成功的关键 是药物的有效性， 同时药物的安全性更为重要。我们需要在严格确保高质量 的 同时，不影响其有效性及工艺的稳定性。这就是法规部门的 要求。 清洗验证是工艺验证中的一项重要部分，验证是 cGMP 所要 求的“证明 任何程序、生产过程、设备、物料、活动或系统 确实能导致预期结果的有 文件证明的一系列活动”。 在生物药物的生产过程中，层析技术是其中最关键的步骤。 生物药物通 过培养，收集，经过层析介质的纯化，最终得到 符合要求的生物药物产品。 在生物制药的分离纯化过程中，培养的物料通过层析介质分离纯化，得到符 合要求的目标产 品。同时，物料中的杂质也污染了层析介质。这些污染物包 括：宿主的蛋白、核酸、脂类，培养过程中的代谢产物、内 毒素、杂菌以及 可能的层析系统的泄漏，试剂中的杂质。这 些污染物在下一次的分离纯化中 将污染目标产品。所以必须 去除或将其降低到安全水平。这就是我们所提到 的层析介质 的清洗(CIP) 过程。通过您的试验证明清洗有效且污染物的残 留 已经降低到安全水平的工作就是清洗验证。层析介质是一 种消耗品，层析介 质的经过一段时间使用，清洗后，污染物 的残留量超过了安全水平，那么层 析介质的寿命就到期了，只有更换新的层析介质才能保证生物药品的质量。 1、层析介质寿命的影响因素： ● 物料的类型以及该层析介质所在工艺中纯化步骤 ● 层析介质的类型 ● 层析柱的维护 ● 整个层析系统的组成 ● 层析柱的装柱质量 ● 试剂等的质量 1.1 物料的类型: 物料是指生物生产过程中含有目标产品的料液。物料的类型 是影响 层析介质寿命的关键因素。不同的物料中含有的杂质 不同。如：大肠杆菌的培养液中，培 养液的上清液中约为10 种蛋白，在外膜与内膜间的胞质中约含 100 种蛋白质，而细 胞膜 内的细胞质中含有 2000 种蛋白质，在细胞质中还含有核 酸、脂类等非蛋白的杂质。所以如 果您的物料是大肠杆菌的 细胞破碎液，那么杂质就相当的多了。由于蛋白的种类不同，所以 在分离您的目标蛋白的时候，这些杂质可能发生沉淀、 变性、聚集等变化，污染堵塞层析 介质。 又如：在抗体生产中使用Protein A 介质纯化。物料是CHO 细胞表达 的上清液。在培养过程中如果培养的条件控制较好，上清液的杂质相对较少， 此Protein A 的介质寿命就会较长。但 是如果 CHO 细胞培养条件控制不好， 细胞裂解，细胞中的蛋 白/核酸等杂质就会影响纯化的条件，介质的寿命就 会受到 影响。如果想要延长介质的使用寿命，就必须使用较强烈的 清洗条 件清洗层析介质。例如: NaOH 或优化清洗剂的条件 等。 Streamline 介质的设计用于捕获步骤，所以此介质易受杂质的 污染， 在清洗时需优化清洗试剂及步骤。 物料： 杂交瘤细胞上清 层析介质：STREAMLINErProtein A 在位清洗步骤：  A: 1.0mM NaOH ，2M Nacl 溶于 20% 的乙醇中，处理 2 小时， 2500px/h 流速  B: 5% 月桂酰肌氨酸钠，20mM EDTA ，0.1M NaCl，20mM NaH2PO4, pH 7.5 处理 1.5 小时  C: 50mM HAC，20% 乙醇 1.2 层析介质所在的纯化工艺中的步骤： 在纯化的工艺开发过程中，我 们建议采用三步法纯化工艺。 捕获→中度纯化→精纯→半成品。在三步纯化 工艺中，不同 的纯化步骤，其纯化工作的目的不同。捕获步骤主要的目的是： 从大量的杂质中捕获目标样品，缩小样品的体积，以便 于后续的纯化工作。 所以此步骤的工作面临的是物料中有大 量杂质。所以此步骤层析介质的清洗 需要比较强烈的试剂， 因此捕获步骤的层析介质的寿命相对较短。 在表 1 中血浆白蛋白纯化过程中使用的离子交换介质在不同 的分离步 骤中，DEAESepharose Fast Flow 阴离子交换介质， 在此工艺