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细菌的培养技术 细菌的培养技术 常用玻璃器材的准备 培养基的成分和作用 培养基的种类 培养基的制备 细菌的接种 细菌的培养 细菌浓度的测定 1.常用玻璃器材的准备 常在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。 玻璃器皿在清洗、干燥后必须经正确的包裹和加塞后才能进行灭菌处理。 2.培养基的成分和作用 培养基：是指人工配制的适合细菌生长繁殖的综合营养基质。 营养物质：蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖醇类、血液、鸡蛋和动物血清、生长因子、无机盐类 水 凝固剂：琼脂、明胶 抑制剂 指示剂 3.培养基的种类（按用途分类） 基础培养基：培养营养要求不高的细菌，如普通平板 营养培养基：能满足营养需求较高细菌的生长，如血平板 鉴别培养基：含有某些特定的底物，用于鉴别细菌，如克氏双糖培养基（KIA） 选择培养基：具有选择性抑制作用，用于选择性的培养目的菌，如SS平板 增菌培养基：促进目的菌的生长，适用于含菌量较少的标本，如葡萄糖肉汤。 厌氧培养基：用于培养厌氧菌 3.培养基的种类（按物理性状分类） 液体培养基：不含凝固剂，用于增菌和接种纯种细菌。 半固体培养基：含0.3％～0.5％琼脂，用于观察细菌的动力。 固体培养基：含2％～2.5％琼脂，多用于细菌的分离培养。 4.培养基制备的一般程序 培养基成分的称取、溶化 各成分须精确称取并防止错乱，最好一次完成。可将配方置于旁侧，每称完一种即在配方上面做出记号；并将所需称取的药品一次取齐置于左侧，每种称取完毕后移放于右侧。 所用化学药品均应是化学纯的。使用的蒸煮锅不得为铜或铁锅，以防有微量铜或铁混入，使细菌不易生长。最好使用不锈钢或玻璃器皿加热溶化。 溶化时先用温水加热并随时搅动以防焦化，如发现有焦化现象则不能使用，应重新制备；待大部分固体成分溶化后，再用较小火力使其完全溶化。 在加热溶化过程中，因蒸发而丢失的水分，最后须补足。因在加热消毒过程中pH会有所变化，待完全溶解后，应进行PH的初步调正。例如，牛肉浸液约可降低pH0.2，而肠浸液pH却会有显著的升高。因此，操作者应注意探索经验以期能掌握培养基的最终PH。 培养基pH的测定 （1）酸碱指示剂法：常用的酸碱指示剂有石蕊、甲基橙、酚酞试液。 （2）用pH试纸测定溶液的pH：用干燥、洁净的玻璃棒蘸取未知溶液点在试纸中部，然后与标准比色卡对比，读出溶液的pH。测定溶液的pH时，pH试纸不能湿润，否则，非中性溶液的pH测定值将比实际pH大（酸）或小（碱）。 （3）pH计测定 培养基pH测定及矫正 材料： 待测培养基、 pH7.4标准比色管、4孔比色架、0.02％酚红、 氢氧化钠0.1mol/L、1mol/L） 盐酸（0.1mol/L、1mol/L） 蒸馏水 试管（与比色管口径一致）、 刻度吸管（5ml、1ml、0.5ml、0.25ml）、 pH矫正 pH矫正 培养基的过滤澄清 液体培养基须绝对澄清，琼脂培养基也应透明无显著沉淀。一般液体培养基可用滤纸过滤法，用于收集滤液,收集沉淀和洗涤沉淀。如用于收集滤液应选用干滤纸,不应将滤纸先弄湿,湿滤纸将影响稀释比例。滤纸过滤一般采用平折法(即对折后,再对折)折叠成折扇或漏斗形，以避免因液压不均匀而引起滤纸破裂,并且使滤纸上缘与漏斗壁完全吻合,不留缝隙。向漏斗内加液时,要用玻棒引导而且不应倒入过快,勿使液面超过滤纸上缘。较粗的过滤可用脱脂棉或纱布代替滤纸.现有离心过滤法, 省时、快捷。 琼脂培养基可用清洁的白色薄绒布趁热过滤。亦可用中间夹有薄层吸水棉的双层纱布过滤。新制肉、肝、血和土豆等浸液时、则须先用绒布将碎渣滤去，再用滤纸反复过滤。如过滤法不能达到澄清要求、则须用蛋清澄清法。即将冷却至55~60°C的培养基放入大的三角烧瓶内，装入量不得超过烧瓶容量的1/2，每1000ml培养基加入1~2个鸡蛋的蛋白，强力振摇3~5分钟，置高压蒸汽灭菌器中、121°C加热20分钟、趁热取出以绒布过滤。 培养基的过滤澄清 培养基的分装 培养基的分装，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内。分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，其外还须用防水纸包扎（现试管一般多有硅胶塞，也有用螺旋盖者）。分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。 分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为洽当。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。每批培养基应另外分装20ml培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，以为测定该批培养基最终pH之用。 培养基的灭菌 耐热培养基:常用高压蒸汽灭菌，103.43k