桑黄化学成分及体外抗肿瘤活性的研究.docVIP

桑黄化学成分及体外抗肿瘤活性的研究 　　[摘要] 综合运用硅胶，Sephedax LH20，RP8，MCI等柱色谱及硅胶薄层制备色谱，从桑黄子实体的95%乙醇提取物中分离纯化得到11个化合物，通过NMR和MS解析技术鉴定为3α羟基木栓烷2酮（1），3羟基木栓烷3烯2酮（2），麦角甾4，6，8 （14），22四烯3酮（3），麦角甾醇过氧化物（4），尿嘧啶（5），尿嘧啶核苷（6），4（3，4二羟苯基）3丁烯2酮（7），原儿茶醛（8），inotilone（9），inoseavin A（10），phellibaumin E（11），其中化合物1，2，5，6为首次从该属真菌中分离得到。采用Cell TiterGLo ATP荧光活性检测法，11个化合物对41株离体肿瘤细胞和2株正常仓鼠细胞高通量筛选，结果显示化合物2～4对髓性白血病细胞系NOMO1和SKM1效果较好，其中化合物2，3体现出较好的选择性（对NOMO1的IC50分别为0.795 5，1.828 μmol?L-1；对SKM1的IC50 10 μmol?L-1）；化合物7对肺癌细胞系H526、前列腺癌细胞系DU145、白血病细胞系HEL效果较为明显（IC50分别为0.533 4，1.885，1.057 μmol?L-1），并显示出较好的选择性；其他化合物体外抗肿瘤作用不显著或没有活性。此外，所有化合物对正常仓鼠细胞系CHL和CHO均无明显作用（IC50 10 μmol?L-1），显示所有化合物对正常细胞无毒副作用。 　　[关键词] 桑黄； 化学成分； 抗肿瘤活性 　　桑黄又名桑臣、桑耳、猢狲眼等，来源于锈革孔菌科针层孔菌属真菌火木针层孔菌Phellinus igniarius （L.ex Fr.） Quel的子实体[1]，主要分布于中国东北、华北、西北及四川、云南等地，在日本、韩国、朝鲜等东亚国家也有分布[2]。桑黄是一种传统名贵中药，素有“森林黄金”之美称[3]，主要用于治疗血崩，血淋，脱肛泻血，带下，闭经等妇科疾病[4]。研究表明其具有抗肿瘤[5]、免疫调节[6]、抗肝纤维化[7]、抗氧化[8]、降血糖[9]、消炎抗菌[1011]等药理作用。尤其，近年来由于其显著的抗癌功能，桑黄已经成为国内外研究的热点，是目前国际公认的生物治癌领域中有效率最高的真菌[12]。大量研究表明多糖类物质是桑黄抗肿瘤的主要活性成分[1316]，目前关于小分子单体化合物的抗肿瘤活性研究报道较少。本研究期望通过对桑黄95%乙醇提取物的化学成分研究，从桑黄中获得结构多样的天然产物，再运用高通量筛选技术寻找抗肿瘤活性显著成分，为进一步深入研究桑黄化学成分及其药理活性奠定基础。 　　1 材料 　　Bruker AM400型超导核磁共振仪；VG Autospec3000型质谱仪；RC1显微熔点仪（四川大学科仪厂）；ZFI紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）；HSGF254型和GF254型薄层色谱硅胶板（烟台江友硅胶开发有限公司）；柱色谱硅胶（200～300目，青岛海浪硅胶干燥剂厂）；制备型薄层色谱板（200 mm×200 mm）；Sephadex LH20 gel（25 ～ 100 μm，Pharmacia公司）；RP8 MB（100 ～ 40/75 μm，Fuji Silysia化工）；MCIgel CHP20P （75～150 μm，日本三菱化工）；化学试剂均为分析纯；Envision多功能酶标仪（Perkin Elmer 公司）；Cell TiterGlo试剂盒（Promega公司）。 　　实验药材桑黄由安徽省大别山康美来生物科技有限公司提供，为人工种植品种，经安徽大学生命科学学院王开金教授鉴定为桑黄P. igniarius，标本保存于安徽医科大学药学院天然药化教研室。 　　2 提取与分离 　　干燥的桑黄样品（6 kg）粉碎后用95%乙醇提取4次，提取液浓缩成浸膏（875 g）后用蒸馏水悬浮， 再依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取。 　　石油醚部分（65 g）经硅胶柱色谱，用石油醚乙酸乙酯（60∶1～1∶1）洗脱，得6个组分（S1～S6）。S3～S6分别经硅胶柱色谱，用石油醚乙酸乙酯（60∶1～10∶1）洗脱，S3得3个组分（S31～S33），S4得4个组分（S41～S44），S5的6个组分（S51～S56），S6得3个组分（S61～S63）。S32经硅胶柱色谱，用石油醚乙酸乙酯（30∶1）洗脱，得化合物1（34 mg）。S43经凝胶sephadexLH20柱色谱，氯仿甲醇（1∶1）系统洗脱，得化合物2（43 mg）。S56和S62经制备薄层硅胶板，分别以石油醚乙酸乙酯（10∶1）和石油醚乙酸乙酯（2∶1）作为展开剂，在紫外灯254 nm下刮下所要的荧光条带，再用氯仿洗脱，最后结合重结晶和