荧光定量CR基础原理.pptVIP

退火：产生荧光信号 结合SYBR Green I SYBR Green I 染料仅在与双链 DNA（dsDNA）结合时发射荧光，所发射的光波是蓝色光。SYBR Green I 不会与单链 DNA 结合，因此变性时荧光强度最低。dsDNA形成单链（图 A）合成双链（图 B）时，SYBR Green I 结合于dsDNA上，结合的 SYBR Green I（绿色光）的荧光信号强度增强。延伸末期（图 C）时，所有 DNA 均是双链，结合状态的SYBR Green I 含量达最大，该 PCR 周期中荧光信号也达最大。因此，通常是在延伸期结束时进行 SYBR Green I 荧光信号测定。 染料法优缺点 优点 缺点 成本低 只能检测单一模板，无法多重检测 通用性好 无模板特异性，非特异性扩张和引物二聚体也产生荧光 适合初步筛查 敏感度低，不能准确测序低拷贝模板 融解曲线功能，分析非特异性扩增 荧光本底高，易引起假阳性 荧光共振能量转移（FRET） 当某个荧光基团的发射谱与另一个荧光基团的吸收光谱重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET)，实际相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽。 Hybprobe探针和水解探针均基于 FRET （荧光共振能量传递）的原理设计的。 TaqMan探针法-水解探针 P