副结核荧光PCR试剂盒研制与应用.PDF

微生物学通报 FEB 20, 2009, 36(2): 292~297 Microbiology © 2009 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ 生物实验室 副结核荧光 PCR 试剂盒研制与应用 1* 1 2 3 1 1 1 1 陈 茹 刘中勇 高小博 刘志玲 吴晓薇 曾碧健 罗长保 林志雄 (1. 510623) (2. 100081) (3. 510642) 摘 要: 采用TaqMan 荧光标记探针技术原理, 建立副结核分枝杆菌特异的实时荧光PCR 快速检 测鉴定方法并组装形成临床诊断试剂盒。试剂盒提供荧光PCR 与样品核酸提取试剂, 检测全程包 括样品处理可在 1 d 内完成。特异性试验结果表明, 试剂盒对 8 株副结核分枝杆菌标准菌株的检 测均呈典型阳性反应, 对牛分枝杆菌、结核分枝杆菌等其它 12 种分枝杆菌标准菌株以及大肠杆 菌、肺炎链球菌等多种常见微生物均呈阴性反应。试剂盒检测灵敏度可达单个菌细胞、15 个基因 拷贝, 比常规PCR 检测灵敏度提高 100 倍。对每份添加50~100 个菌细胞的20 份阴性牛奶样品进 行检测, 均呈阳性反应。重复性试验结果显示, 试剂盒组内变异系数为 1.41%, 组间变异系数为 2.42% 。采用所研制的副结核分枝杆菌荧光PCR 试剂盒对来自广东地区7 个奶牛场的250 份牛奶 样品和粪便样品、来自 10 个养猪场的 143 份猪血清样品, 以及3 批次进口食蟹猴共 100 份血清样 品进行检测, 检出牛奶样品中副结核分枝杆菌阳性率为 7.7%, 牛粪样品中阳性率为3.7%, 猪血清 样品中阳性率为 8.2%, 进口猴血清样品中阳性率为3.0% 。 关键词: 副结核分枝杆菌, 荧光PCR, 试剂盒, 动物感染调查 Development and Application of a Real Time PCR Detection Kit Specific for Mycobactium paratuberculosis CHEN Ru1* LIU Zhong-Yong1 GAO Xiao-Bo2 LIU Zhi-Ling3 WU Xiao-Wei1 ZENG Bi-Jian1 LUO Chang-Bao1 LIN Zhi-Xiong1 (1. Guangdong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Guangzhou, Guangdong 510635, China) (2. Beijing LabX Corporation Ltd, Beijing 100085, China) (3. South China Agriculture University, Guangzhou, Guangdong 510642, China) Abstract: The real time PCR method based on TaqMan fluorescent DNA probe that specific for Mycobacte- rium paratuberculosis det