热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性-微生物学报.PDF

微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 2016, 56(9): 1477-1485 /actamicrocn DOI: 10.13343/ki.wsxb Research Paper 研究报告 热稳定酯酰辅酶A合成酶的异源表达及酶学特性 1, 2 1 1 1 * 董爽爽 ，王衍杰，季俊杰，郑舰艇 1 中国科学院过程工程研究所，生化工程国家重点实验室，北京 100190 2 中国科学院大学，北京 100049 摘要： 【目的】为寻找能合成丙酰辅酶A和丁酰辅酶A等聚酮合成前体的生物催化剂，用体外酶学实验 对一个酯酰辅酶A合成酶进行了表征。【方法】利用丙二酰辅酶A合成酶作为输入序列，通过BLAST程 序在Caldicellulosiruptor owensensis OL的基因组中找到1个酯酰辅酶A合成酶基因。在大肠杆菌中进行了 异源表达，并通过亲和层析进行纯化。底物谱、最适反应条件、稳定性和动力学参数通过体外酶学实验 进行表征，而定点突变则用于活性中心的氨基酸残基的分析。【结果】该酶具有较好的底物宽泛性，可 识别丙酸、丁酸、2- 甲基丙酸、戊酸、3- 甲基丁酸、2- 甲基丁酸以及环己甲酸等一系列单酸。反应最适 温度为30 °C ，最适pH为7.0。70 °C保温8 h后仍有45% 的活性残留，表明该酶相对比较稳定。通过活性中 心3个位点的定点突变可以改变酶的底物特异性。【结论】C. owensensis OL来源的酯酰辅酶A合成酶是 潜在的生物催化剂，可以用于聚酮前体的合成。 关键词：热稳定性, 酯酰辅酶A合成酶, 底物特异性, 酶学性质, 定点突变 [4] 聚酮是由细菌、真菌及植物等产生的一大类 的重要原因 。 结构复杂多样的天然产物，在现代医疗中发挥重 聚酮合成前体包括延伸单元和起始单元。前 [1–3] 要作用，如抗感染、抗肿瘤以及免疫抑制等 。聚 者主要包括丙二酰CoA和甲基丙二酰CoA ；后者 酮的生物合成与脂肪酸类似，由辅酶A (coenzyme 更为多样化，包括乙酰CoA 、丙酰CoA 、2- 甲基 [5–6] A ，CoA)活化的短链酸通过连续的脱羧聚合形成 丙酰CoA 、2- 甲基丁酰CoA和环己甲酰CoA等 。 聚酮核心骨架，再经一系列复杂的后修饰而形 体外酶学重组是研究聚酮生物合成机制以及制备 成，如糖基化、甲基化和氧化等。与脂肪酸合成 特定聚酮产物的有效手段，然而上述合成前体价 主要利用丙二酰CoA相比，聚酮的生物合成可以 格非常昂贵，很多根本没有商业化的产品，限制 利用更多种类的羧酸前体，这是聚酮结构多样性