第7章_第7节_基因操作与医学(3_LMJ)讲义教材.pptVIP

* * 显微注射法等传统的转基因技术具有随机性和不可预见性、整合率、表达低等式缺陷。 外源基因的拷贝数和整合位点都是随机的； 小鼠,大鼠,兔,牛,猪,绵羊阳性率分别为26%、44%、15%、0.7%、0.9%、0.9%。 整合率极低，得到的转基因动物数量更少。 采用非受精卵还出现嵌合体； 受到宿主染色体上整合位点的影响，大部分转 基因表达水平较低。 * * 即体细胞克隆技术，是用显微操作、电融合等方法将动物体细胞的细胞核全部导入另一个个体的去除细胞核的卵细胞内，使之发育成为个体。 * * 核转移技术可使一个细胞变成一个个体，所产生的个体携带的遗传物质与细胞核供体的遗传物质完全一样，是一种无性繁殖过程，即克隆(clone)。 （三）核转移技术简介 * * 1.动物克隆——转移的核末经修饰 * * * * 多利羊诞生于1996年7月5日，1997年首次向公众披露。 被美国《科学》杂志评为1997年世界十大科技进步的第一项，也是当年最引人注目的国际新闻之一。 科学家认为，“多利”的诞生标志着生物技术新时代的来临。 1997年2月27日《Nature》报道，维尔穆特(Wilmut)和坎贝尔(Campbell)利用克隆技术培育出一只小母羊。 * * 坎贝尔利用克隆多利时冷冻保存下来的，同一只母羊乳腺组织样本，克隆出“多利四羊组”。 转基因动物可以作为天然的生物工厂，合成多肽和蛋白质等生物活性物质，制备药物、抗体和疫苗等，称为动物生物反应器(animal bioreactor)。 生物药物生产主要通过乳腺生产(动物乳腺生物反应器)，少数通过肾脏和膀胱。 用于表达的生物反应器包括动物血液、泌尿系统、精囊腺、乳腺等，还包括禽蛋和昆虫（例如家蚕）个体等。 2.转基因动物生物反应器的制备 —转移的核经过修饰 * * * * 1997年6月伊恩·维尔穆特(Wilmut)报道用基因改造过的胎儿成纤维细胞为核供体，获得了表达人凝血因子IX的转基因克隆绵羊“波莉”。 成功克隆出携带有人凝血因子ＩX基因的绵羊早期 胚胎成纤维细胞； 以该细胞系为核供体移植到去核卵母细胞中，经 过处理后将卵母细胞植入假孕绵羊体内发育。 获得3只能高水平表达人凝血因子ＩX（125μg/ml） 的绵羊。 人体移植器官短缺是一个世界性难题，研究人员把目光移向动物以寻求可替代移植器官。 猪器官的体积、形状和DNA基本与人类相似，是理想的器官供应者，但这种器官移植的主要问题之一是免疫排斥。 三、制造用于移植的细胞、组织和器官 * * 解决办法之一： 通过转基因技术，特别是基因打靶技术： 敲除α-半乳糖抗原决定基因，再结合克隆技术，培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪的器官。 向供体器官基因组敲入某种调节因子，抑制α-半乳糖抗原决定基因的表达； * * * * （一）基因打靶技术简介 可在细胞水平进行，从而建立新的细胞系；也可在动物整体水平进行，以建立基因剔除动物。 基因打靶(Gene targeting)，是一种在胚胎干细胞(ES)技术和同源重组技术的基础之上，定向改变生物体内某种基因的技术。 基因敲除(gene knockout)：定向敲除某种基因 基因敲入(gene knockin)：定向替代某种基因 基因操作 第七章 Gene Manipulating * * * * 一、疾病相关基因分析 要确认某一疾病的相关基因，就是利用不同的方法将各种基因确定到染色体的实际位置上，并分析基因的结构和疾病状态下基因的突变。 1911年Wilson将红绿色盲基因首次定位到X染色体上，开创了人类基因定位的先河。 1968年Donahue利用系谱分析将Duffy血型基因定位于1号染色体上，这是人类首次将基因定位于常染色体上。 * * 20世纪80年代以前，可进行结构分析的疾病相关基因仅限于个别功能异常非常明确，基因表达产物纯化较易的遗传性疾病，尤其是血液系统疾病如镰刀状贫血、地中海贫血等。 20世纪80年代中期以后，随着分子生物学技术的发展，尤其是重组DNA技术水平的提高和PCR技术的广泛应用，使疾病相关基因的鉴定与克隆工作得以迅速发展。 * * （一）功能性克隆(functional cloning) ——从对一种致病基因的功能理解出发，克隆该致病基因。实际上是利用纯化蛋白克隆致病基因。 获得纯化蛋白后的基因克隆方式有两种： 获取部分氨基酸序列，推导出mRNA序列，合成 寡核苷酸探针，筛选 cDNA 文库；从基因组文库 获取其基因组序列。 制备特异性抗体，筛选表达型cDNA文库