试验聚丙烯酰氨凝胶电泳测定蛋白质分子量.PPT

实验 聚丙烯酰氨凝胶电泳测定蛋白质分子量 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 聚丙烯酰胺凝胶是由聚丙烯酰胺（称单体）和甲叉双丙烯酰胺（称交联剂）在催化剂作用下，通过自由基引发聚合反应，形成不带电荷、且具有分子筛性质是网状结构凝胶。凝胶的物理性质如：筛孔大小、机械强度、透明度等。很大程度上取决于两个参数，即凝胶浓度和胶联度。随着两个参数的变化，可获得对欲检测分子分离、分辨的最适合孔径。 PAGE 连续系统 凝胶缓冲液pH值及凝胶浓度不变；电荷效应；分子筛效应； 不连续系统 凝胶缓冲离子成分、pH、凝胶浓度、电位梯度不连续；有浓缩胶和分离胶组成；电荷效应；分子筛效应；浓缩效应； native PAGE SDS—PAGE 在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS），蛋白质分子被大量SDS阴离子包裹，消除了它们间原来携带的电荷差别，因而其电泳迁移率仅反映蛋白质分子大小，故广泛用于蛋白质分子量的测定；样品处理液中SDS和巯基乙醇的存在使蛋白质亚基解离、肽链间二硫键打开形成单个肽链，因此测定结果只是亚基或单条肽链的分子量。 步骤 安装电泳槽 配胶 12%分离胶（7.5ml） 5%浓缩（3ml） H2O 2.48 1.72 30.8%Acr-Bis 3 0.5 1.5M Tris，PH8.8 1.9 0 0.5M Tris，PH6.8 0 0.76 10%APS 0.04 0.03 TEMED 0.005 0.003 凝胶液的灌注和聚合 将所配凝胶沿着凝胶腔的长玻璃板内面缓慢用滴管滴入，小心不要 产生气泡；将胶液加到距短玻璃板上沿2-3cm处为止；再沿内壁缓慢注入蒸馏水或正丁醇进行水封，静置进行聚合反应，待水和胶之间出现明显界线为止。 倒去水封层，用滤纸吸去残留水液，加入浓缩胶，将梳子轻轻插入胶液顶部，静置聚合。 样品处理 取样品和上样缓冲液（甘油/蔗糖、Tris-HCl、SDS、巯基乙醇、溴酚蓝）按比例配置，混匀，100°C加热3分钟，取出冷却。 加样 在垂直型电泳装置的两个半槽内分别加入电泳缓冲液，用微量注射器取样品混合液20-30ul，加在各个样品槽内。 电泳 上槽接负极，下槽接正极，打开电泳仪进行电泳。开始时电流调至10mA，待样品进入分离胶后，电流升至20-30mA。待指示染料迁移至距下缘1-1.5cm，停止电泳，取下胶。 固定 染色 考马氏亮蓝R250，可选择性地与蛋白结合； 脱色 样品相对分子量确定 相对迁移距离=蛋白质迁移距离/染料迁移距离 以标准蛋白质相对分子量的对数（lgMr）为纵坐标，相对迁移距离为横坐标，得到标准曲线，然后根据样品蛋白质分子的相对迁移距离，从标准曲线上查出其相对分子量。 * * F G f