18-生物化学实验--吴宪-Folin法测定血糖含量.docVIP

吴宪 -Folin 法 测定血糖含量 【目的】 1 ．掌握吴宪 -Folin 法测定血糖含量的实验方法。 2 ．熟悉吴宪 -Folin 法测定血糖含量的实验原理。 【原理】 钨酸钠（ Na 2 WO 4 ）和硫酸作用，生成钨酸，可沉淀血液样品中的蛋白质滤除蛋白质沉淀即可制得无蛋白血滤液，此血滤液中的葡萄糖具有还原性与硷性铜试剂共热可使兰色的二价铜离子（ Cu 2+ ）还原成红色的氧化亚铜（ Cu 2 O ）沉淀。氧化亚铜再使无色的磷钼酸还原成兰色的钼兰。颜色深浅与葡萄糖含量成正比。因此，将血滤液和经同样处理的标准葡葡萄溶液分别进行比色，即可求出血糖含量。其反应如下： 1 ．硷性铜试剂内的反应 2 ．定糖显色反应 【器材】 1 ． Folin- 吴氏定糖管 2 ．中号试管 3 ．电炉及加热器 4 ． 刻度吸管 5 ．微量移液器 6 ．漏斗 7 ．分光光度计 【试剂】 1 ． 1/3mol/L 硫酸溶液 2 ． 10% 钨酸钠 3 ．碱性铜试剂 取无水碳酸钠 40g 溶解于 400ml 蒸馏水中，再加入酒石酸 7.5g ，溶解后定量地移入 1000ml 量瓶中，再加入结晶硫酸铜 4.5g （可先用热水浴稍微加热），待其完全溶解后加蒸馏水至刻度，混匀贮于棕色瓶中保存。 4 ．磷钼酸试剂 取钼酸（ H 2 MoO 4 ） 35g 和钨酸钠 5g 加入 1000ml 平底烧杯中，加入 10% 的氢氧化钠 200ml ，蒸馏水 100ml 煮沸 20-40 分钟以除以钼酸试剂中可能存在的氨。冷却后加蒸馏水使全量为 350ml 。再加入浓磷酸（ 85% ） 120ml ，最后加水蒸馏水至 500ml 。 5 ． 葡萄糖标准液 （ 1 ）储存液（ 1mg/ml ） ：精确称取葡萄糖 1.00g 置于 1 000ml 量瓶中，加入防腐剂 0.25% 苯甲酸溶液至刻度。 （ 2 ）应用液（ 2.5mg/dl ）：临用时，取上述储存液 25ml ，注入 1000ml 量瓶中，加蒸馏水至刻度处。 【操作】 1 ．无蛋白血滤液的制备 取小锥形瓶 1 个，准确加入蒸馏水 7ml ，用 0.2ml 干燥移液管准确吸取全血 0.2ml 。用小块滤纸擦干吸管外面附着血液，然后徐徐地将血液放入水中（将吸管尖端放在锥形瓶液面以下），待血液放完以后再吸取锥形瓶内液将试管洗涤二次。吸管内最后一滴液体吹出，混匀，透明呈宝石红色。加 1/3mol/L ，硫酸液 0.4ml 混匀再加 10% 钨酸钠溶液 0.4ml 、充分混匀。放置 5 分钟，待溶液由棕色透明变为咖啡色混浊后，用多层干燥滤纸过滤于一干燥的试管中，即得 40 倍稀释的钨酸血滤液。滤液必须无色透明，如发现混浊，即证明尚有蛋白质存在，不合要求，应重新制备。 2 ．血糖测定 取干燥洁净的 Folin- 吴氏定糖管 3 支，标号，按下表操作： 试剂（ ml ） 测定管 标准管 空白管 无蛋白血滤液 2.0 - - 葡萄糖标准液 - 2.0 - 蒸馏水 - - 2.0 硷性铜试剂 2.0 2.0 2.0 充分混匀，置沸水浴准确煮沸 8 分钟，取出切勿摇动，以自来水冲冷 3 分钟，各加磷钼酸试剂 2.0ml 。混匀，放置 3 分钟，待兰色反应完全后，将上述各管加蒸馏水稀释至 12.5ml 刻度处，用拇指或手掌堵严管口，倒转 1 ～ 2 次，充分混匀，放置 10 分钟后，于波长 620nm 处，以空白管调零点，进行比色，分别读取并记录各管吸光度值。 【计算】 血糖浓度（ mg/dl ）＝ 血糖浓度 ( mmol/L) ＝ 【注意事项】 1 ．血液不能放置过久，以免血糖分解致使含量降低。 2 ．在制备无蛋白血滤液时，加各种试剂的顺序不能颠倒，每加一种试剂后应充分振摇以免形成血块蛋白沉淀不完全。 3 ．葡萄糖与硷性试剂的硷性、各成分的浓度、加热的温度及时间等均有关。因此操作时应力求条件恒定。 4 ．加入磷钼酸试剂后显色不稳定，应迅速进行比色。 5 ． 本法测定的是血中还原性糖的含量，所以血糖正常值为 80 ～ 120 mg/dl 或 4.4 ～ 6.7mmol/L ，比葡萄糖氧化酶法测定值高。目前临床多用专一性高的葡萄糖氧化酶法。 【思考题】 1 ．定糖管球部上端为何有又细又长的颈？ 2 ．制备无蛋白血滤液时，加入试剂的顺序能否颠倒，为什么？ 3 ．人空腹血糖浓度是多少？机体如何调节血糖浓度？