实验六氨基酸纸层析法.doc

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氨基酸的纸层析法 一.目的 了解并掌握氨基酸纸层析的原理和方法。 二、原理 以滤纸为支持物的层析法,称为纸层析法。纸层析所用展层剂大多由水和有机溶剂组成。展层时,水为静止相,他与滤纸纤维亲和力强;有机溶剂为流动相,它与滤纸纤维亲和力弱。有机溶剂在滤纸上又下向上移动的,称为上行法;有上向下移动的,称为下行法。 将样品在滤纸上确定的原点处展层,由于样品中各种氨基酸在两相中不断进行分配,且他们的分离系数各不相同,所以不同的氨基酸随流动相移动的速率也不相同,于是各种氨基酸在滤纸上就相互分离出来,形成距原点不等的层析点。 在一定条件下(室温、展层剂的组成、滤纸的质量、PH值等不变),不同的氨基酸有固定的移动速率(Rf值)Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。用混合氨基酸做样品时,如果只用一种溶剂展层,由于某些氨基酸的移动速率相同或相近,就不能将它们分开,为此,当用一种溶剂展层后,可将滤纸旋转90度,以第一次所的层析点为原点,在用另一溶剂展层,从而达到分离的目的。这种方法称为双向层析法。 本试验主要介绍的是单向层析法。其中混合氨基酸有精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸组成。 三、实验仪器 1、?新华滤纸 2、?层析缸 3、?细线 4、?点样管 5、?橡皮筋 6、?电吹风 7、?喷雾器 四、实验试剂 1、?混合氨基酸(精氨酸,酪氨酸,苯丙氨酸) 2、展层剂:正丁醇:12%氨水:95%乙醇:蒸馏水=13:3:3:1(v:v) 3、0.5%茚三酮—无水丙酮溶液:0.5g茚三酮溶于100ml无水丙酮,贮于棕色瓶中 五、实验步骤 1、取滤纸剪成20×10厘米的滤纸条一张,在一端打孔,系一根细线,在另一端2~3cm处用铅笔画一横线,中间画一圆点(原点)。 2、取毛细管一支(回收),吸取氨基酸混合液,在原点处点样,样点直径不宜超过5mm,每点一次用吹风机吹干,点2~3次为佳。 3、点样后将滤纸放入层析缸中展层,注意点样线要高于层析液面,滤纸不要贴在层析缸璧上,当展层至另一端1~2cm处时,停止展层(大约2~3小时)。 4、取出滤纸,用铅笔记下溶剂前沿,然后用热风吹干(或烘箱60℃)烘干。 5、均匀喷上茚三酮—无水丙酮液,注意使溶液不倒流,不间断。 6、用吹风机吹干,观察层析点,确定其几何中心。 7、量取数值,计算各自的Rf值,与表中标准氨基酸Rf值比较,确定样品氨基酸种类。(书上图谱横着看) 六.实验结果 从左到右依次为H、H1、H2、H3、H4。 从左到右依次为H、H1、H2、H3、H4。 H1=1.0cm H2=4.4cm H3=5.0cm H4=0.99cm H=11.7cm 由此可得 Rf1=0.08547 Rf2=0.37607 Rf3=0.42735 Rf4=0.08461 据此可知,混合氨基酸是由甘氨酸(Gly)和苯丙氨酸(Phy)组成。 七.实验分析 实验中出现了拖尾的现象。 拖尾现象是指展层,显色后在层析分配图上,所看到的某一种氨基酸的分子位移,不是如标准图谱所示的那样,完整地显示在某一位置上,而是形成象笤帚似的那样,前端粗圆而逐渐细小下来,宛如拖着一个尾巴。其图所呈颜色也是由浓渐淡。 图象的出现,是在实验中对影响Rf值的主要因素要求,掌握不够所致。诸如,物质结构与极性对Rf值的影响,层析溶剂对Rf值的影响,PH对Rf值的影响(溶剂、滤纸和样品的PH值),温度对Rf值的影响,滤纸的质地是否均匀,薄厚是否适当,纤维的松紧度是否适中等对Rf值的影响,展层的方式(上行、下行)对Rf值的影响。然而在多次实验过程中无论怎佯严格遵循其影响Rf值的主要因素的要求,都仍不可避免地要出现拖尾现象。此时,这就需要从具体操作规范方面,诸如样品的处理,点样、展层、显色等几个操作程序去考虑思索,经仔细分析,样品的处理是为除去杂质纯化样品,达到层析分配某氨基酸的情晰显色图像;展层过程是在上述影响Rf值的主要因素要求下进行,使样品达到一个适当的位移,便于在显色后从图象上,区分不同样品的氨基酸;显色是在用配制好的,与水不相混合,并挥发性较快喷雾后迅速吹干的。更何况显色剂又是含水量极低,不会影响洋品的斑点扩散,那么问题就集中在点样这个操作程序上了。点样是将被层析分配的几种氨基酸混合液,和为了对照实验结果,而分别配制的几种氨基酸的溶液,用微量点样管或毛细管,或血球计数器将5一j5微升的样品,点在以滤纸为惰性支持物的层析纸上设计好的多点位置中去。点样后要自然风干,或冷风吹干。最好不要用加热装置,如吹风机,灯泡之类的热源将其样品点加速干燥。因为加热装置在学生操作时,一但注意不够,掌握不好,则温度升高势必要使样品破坏,更会使佯品点干的太燥。正是由于这样,样品点太干燥,使其样

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