BIO-RAD荧光定量PCR——科研培训材料-精品·公开课件.pptVIP

荧光定量PCR原理和方法介绍 陈寅清 BIO-RAD , CHINA June,2005 提 纲 荧光定量PCR的原理和应用 Ct值的设定 扩增产物的相对荧光强度达到设定的阈值时所经过的循环数。 1) 设定基线 2) 设定阈值 3) CT 值就是扩增曲线和阈值的交点所指示的循环数。 阈值设定的越高， CT值越大 。 Ct值和起始模板量的对应关系 Correlation Coefficient, Slope and PCR Efficiency (cont.) 荧光PCR的原理 插入染料法 杂交探针法 插入染料方法的原理 退 火 产生很强的荧光信号 容易设计和合成 可以做多重检测 能够进行SNP (Single Nucleotide Polymorphism) 检测 比插入染料贵 Taqman 探针设计 Tm值比引物高10℃ 长度不超过30bp 5’端不能是G SNP 检测，较Taqman探针有更大的温度选择性 多重PCR 难设计和合成 产生的荧光信号较低 价格昂贵 FRET 探针 特异性好 SNP 检测 难设计 费用昂贵 常用的荧光基团 应 用 相对定量 绝对定量 突变检测 等位基因检测 相对定量 参考基因：Actin, GAPDH, 18sRNA 绝对定量 构建标准曲线： A、按照扩增片段的序列，人工合成一段寡聚核苷酸