李劲松实验报告real-timePCR-精品·公开课件.pptVIP

Real-time PCR使用及引物筛选时数据分析 报告人： 李劲松 报告内容 1 Real-time PCR原理 2 PCR体系配制 3 Real-time PCR软件操作 4 Real-time PCR的两个用途 5 当前所遇问题及可供参考的解决方向 6 荧光数据处理及代码自动寻找最佳分离温度尝试 1 Real-time PCR原理 某些荧光物质与DNA双链结构结合后，其荧光性会剧烈改变，而当DNA双链解开后，其荧光性又会恢复。比如我们使用的Eva Green核酸染料与DNA双链结合，受到同等条件的激发，核酸染料的荧光性会大幅度成倍增加。因此我们在PCR体系中加入过量的核酸染料后，可以通过检测荧光量得知DNA双链分子的量。 Real-time PCR即实时定量PCR，正如其名子一样，在整个 DNA扩增或DNA溶解过程中，仪器能够每隔一定时间或温度（我们使用的仪器温度间隔0.1℃）反馈一个PCR管内体系当前荧光信息，用以反映当前双链DNA分子量。 2 PCR体系配制 2.1模板：取IR64以及日本晴叶片鲜样，剪刀剪碎， 连同0.4mol/L NaOH(40ul每孔)、0.1mol/LTris-HCl(pH7.5，160ul每孔)、钢珠加入管中磨碎混匀，离心后取上