实验二过氧化氢酶Km值的测定(精).docVIP

PAGE PAGE 1 教案首页 第 2 次课 授课时间：2006年11月5日～11月9日 课程名称 生物化学与分子生物学实验课 年级 2006 专业、层次 临床医学本科 授课教师 许成山 职称 助教 课 型(大、小) 小 学时 3 授课题目（章、节） 实验二 过氧化氢酶Km值的测定 基本教材或主要参考书 自编生物化学与分子生物学实验指导 教学目的与要求： 1、巩固酶促反应有关参数的知识，加深理解Km值的定义； 2、学习Hanes作图法测定Km值的原理和方法； 3、掌握滴定管的使用和滴定终点的判断。 大体内容与时间安排，教学方法： 1、Km值的定义及求Km值的作图方法（林-贝氏作图法和Hanes作图法） 5min 2、过氧化氢酶Km值测定的原理 5min 3、过氧化氢酶Km值测定的注意事项 10min 4、学生做实验 100min 教学方法：实验+示教 教学重点、难点： 重点：1、Hanes作图法求Km值 2、过氧化氢酶Km值测定的原理 3、滴定管的使用和滴定终点的判断 难点：过氧化氢酶Km值测定的原理 教研室审阅意见： 教研室主任签名： 年 月 日 基本内容 手段 课堂设计和时间分配 一、Km值的定义： 二、Km值的作图方法 （一）双倒数作图法 （林－贝氏作图法） （二）Hanes作图法 三、过氧化氢酶Km值测定的原理 四、实验操作 五、注意事项 六、实验结果 七、学生做实验 提问 简图 简图 示范操作 在实验过程中进行巡视，注意纠正学生的不规范操作 1min 当酶促反应速度等于最大反应速度一半时的底物浓度即为Km值；Km值是酶促反应的特征性常数。 4min 以1/[S]为横坐标，以1/V为纵坐标求Km值。 [S]/V为横坐标，以[S]为纵坐标求Km值。 5min 1、H2O2在过氧化氢酶的作用下分解生成了H2O和O2； 2、[S]=加入的H2O2的量； 3、V=固定时间内反应掉的H2O2的量=加入H2O2的量－剩余H2O2的量； 4、剩余H2O2的量可通过KMnO4滴定测出： 2KMnO4+5H2O2+3H2SO4→2MnSO4+K2SO4+5O2+8H2O 1、只做第3步； 2、表格下：将各瓶置于37℃水浴预热5min 10min 1、加入1:1000稀释血清0.5ml/瓶后保温准5分钟； 2、硫酸的浓度较大，小心不要溅出!!! 3、作图应该用坐标纸，标明有关参数 4、滴定操作： （1）使用滴定管前要先检查滴定管是否漏水或有堵塞； （2）滴定管使用前还要润洗（加KMnO4至刻度线24ml处； （3）使用时，不能左右推动活塞（要以环指顶住管壁，拇指、食指和中指控制流量； （4）加滴定液时，液面要稍高于0，尔后排除尖端气体； （5）读数时，视线要与液面凹陷最低点平行。 列表计算出有关数据，在坐标纸上作图求出Km值。 100min 小 结 Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质，酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。 复习思考题、作业题 已知某种酶的Km值为0.05mmol/L，试问要使此酶所催化的反应速度达到最大反应速度的80%时底物浓度应是多少？ 下次课 预 习 要 点 质粒转化的相关概念。 参考内容:《生物化学与分子生物学实验技术》 或《分子生物学实验技术》中“DNA重组技术”相关内容。 实 施 情况及 分 析