《分子克隆》精选课件.pptVIP

谢谢大家！ * * ① pBR322 pBR322是研究得最清楚应用也最广泛的质粒，全长4363bp，由3种野生质粒成分构建而成，含有Ampr和Tetr两个抗药基因标记，一个复制起始点(ori)， ② pUC18/pUC19 pUC系列质粒是由大肠杆菌pBR质粒和M13噬菌体改建而成的质粒载体。全长2674bp，具有氨苄青霉素抗性基因，一个复制起始点。pUC系列质粒带有一段大肠杆菌Lac操纵子DNA片段，能编码β-半乳糖苷酶氨基端的一部分，同时与大肠杆菌的gal-基因互补。 当pUC质粒转化到gal-的宿主菌后，在含有诱导物IPTG和生色底物X-gal的培养基上形成蓝色菌落；如果外源DNA片段克隆到pUC的Lac基因区域时，造成Lac基因失活，在含有IPTG、X-gal的培养基上将生成白色菌落。 一种典型的头-尾结构，双链线状DNA分子，全长50kb，含66个基因，在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点 λ噬菌体 一种典型的纤维状结构，其DNA分子相比λ噬菌体要小的多，长度仅6407个核苷酸，通常为环状双链DNA M13噬菌体 4.目的基因的分离与制备 ⑴、人工合成基因 ⑵、应用聚合酶链反应获取目的基因 5.目的基因的体外重组 DNA分子的体外重组:是DNA分子之间的连接过程。这是一个DNA连接酶催化的生物化学反应 。 Ⅰ．粘性末端连接法(cohesive end ligation) Ⅱ．平头末端连接法(blunt end ligation) Ⅲ．人工接头法(artifical linker) Ⅳ．同源多聚尾序(homopolymeric tails)连接法 6.重组子导入宿主细胞 体外重组生成的重组子必须导入到合适的宿主细胞中才能进行复制、扩增和表达。 宿主细胞分为两种：原核细胞和真核细胞。 ⑴感受态细胞(competent cell): 系指利用理化的方法人工诱导细菌，使之处于易于吸收和容纳外源DNA分子的状态，这时的细胞就称为感受态细胞。 ⑵转化过程： ①.用冰预冷的CaCl2处理细胞：即用低渗CaCl2溶液在0℃时处理快速生长的细胞，从而获得感受态细胞。 ②.此时细胞膨胀成球型，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面。 （二）DNA进入细胞： ③.通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。 ④.然后将细胞接种于含相应抗生素的培养基上，含有重组子的感受态细菌将形成单菌落。 ⑤. 挑选单菌落进行相应的筛选及鉴定分析。 7.阳性重组子的筛选和鉴定 ⑴、根据遗传表型筛选 ⑵、应用限制性内切酶酶切分析筛选 ⑶、核酸探针筛选 ⑷、PCR筛选 ⑸、菌落原位杂交技术 大多数克隆载体均带有抗生素抗性基因，常见的有抗氨苄青霉素基因(Ampr)、抗四环素基因(Tetr)、抗卡那霉素基因(Kanr)等。如果外源DNA片段插入载体的位点在抗药性基因之外，不导致抗药性基因的插入失活，仍能编码抗药性基因，这种含有重组子的转化细胞能够在含有相应药物的琼脂平板上生长成菌落。 但是除阳性重组子以外．自身环化的载体、未酶解完全的载体以及非目的基因插入载体形成的重组子均能转化细胞而能生长，故本法仅是阳性重组子的初步筛选。 对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA，用相应的内切酶(1种或2种)切割重组子释放出插入片段，对于可能存在双向插入的重组子还要内切酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小。 PCR技术具有高度的灵敏度和特异性，能在极短的时间内将目的基因扩增至数百万倍，通过电泳，可直接观察到产物的存在。 保护碱基 在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位点不容易直接被限制性内切酶切开，因此在设计PCR引物时，人为的在酶切位点序列的5‘端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。 　　 （一）基本概念: 克隆（Clone) 指的是通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。 分子克隆（Molecular Cloning) 是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程。 载体DNA （vector） 目的DNA （target fragment） 重组DNA （recombinant DNA ） 宿主（host） 筛选、扩增 克隆（clone） 分子克隆的路线 DNA 重组 转化 分—获取目的基因