雷公藤多苷对ACD小鼠体外培养T淋巴细胞亚群的影响.docVIP

雷公藤多苷对ACD小鼠体外培养T淋巴细胞亚群的影响 　　摘要：目的探讨雷公藤多苷对体外培养的变应性接触性皮炎（ACD）小鼠T淋巴细胞亚群影响。方法以2，4-二硝氯苯（DNCB）制作ACD小鼠模型，分离淋巴细胞，各浓度雷公藤多苷体外作用48h后，利用流式细胞仪检测CD3+T，CD4+T，CD8+T细胞数量。结果雷公藤多苷可以显著抑制Th（CD4+T）细胞的表达（P＜0.01），高低浓度比较差异具有显著性（P＜0.01），高中浓度组间、中低浓度组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。雷公藤多苷可以降低ACD小鼠体外培养的Tc淋巴细胞（CD8+T）数量，抑制Tc细胞的表达。雷公藤多苷高浓度可以降低ACD小鼠体外培养的CD3+淋巴细胞数量，抑制CD3+细胞的表达（P＜0.01）。结论雷公藤多苷可以减少成熟T淋巴细胞表达，非特异性地降低Ⅳ型变态反应主要效应细胞CD4+T及CD8+T亚群的表达，可能是雷公藤多苷治疗ACD的免疫抑制机理之一。 　　关键词：雷公藤多苷；变应性接触性皮炎；T细胞亚群雷公藤是卫矛科雷公藤属的木质藤本植物,最早收载于《神农本草经》，味苦，辛凉，有大毒，气味特异，其药用部位主要为根及根茎。雷公藤成分复杂，雷公藤多甙(又称：雷公藤总甙)是目前临床应用的最广泛的雷公藤制剂之一,是雷公藤根芯部分用水和氯仿提取，经柱色谱分离得到的一种有效组分[1]，其生物活性是由多种成分(二萜内酯、生物碱、三萜等)协同产生。本项目拟通过实验探讨雷公藤多苷对变应性接触性皮炎(ACD)小鼠体外培养T淋巴细胞亚群影响。 　　1器材 　　1.1动物6~8w龄昆明鼠，雄性，购自天津医科大学动物实验中心。 　　1.2仪器超净工作台（苏净集团安泰公司），CO2培养箱（Thermo公司，德国）；倒置显微镜(OLYMPUS，日本)；台式高速离心机(北京医用离心机厂，日本)；流 式 细 胞 仪(FACSCalibur型美国BD公司,美国), 　　1.3试剂RPMI-1640培养液（Gibco公司），胎牛血清（中国医学科学院血液病研究所），2，4-二硝氯苯（1-chloro-2:4-dinitrobenzene,DNCB）（天津市化学试剂公司），PE anti-mouse CD8（PE标记抗鼠CD8荧光抗体）；PE anti-mouse CD4（PE标记抗鼠CD4荧光抗体）；FITC anti-mouse CD3（FITC标记抗鼠CD3荧光抗体），雷公藤多苷购自浙江得恩德制药有限公司。 　　2方法 　　2.1 ACD小鼠模型制备剪除小鼠背部3cm2鼠毛，涂抹5%DNCB；10d后，小鼠耳廓内外两侧涂抹1% DNCB。1w后激发一次，重复四次。第四次激发后24h后观察皮损状况，并取背部及耳部皮肤组织病理检查。HE染色后，观察炎性细胞浸润，表皮细胞间水肿、细胞内水肿，网状变性、表皮坏死，确定模型成功。 　　2.2 ACD小鼠淋巴细胞分离培养小鼠颈椎脱位处死无菌取脾脏，研磨脾脏，收集脾细胞悬液，离心悬浮细胞，计数，调整为浓度2×106/mL，然后平均分为4组，分别加入含有药物的RPMI-1640培养液（药物浓度分别为雷公藤多苷0，1，2，4μmol/L)，每组一式3孔。混匀后放入含有5%CO2的CO2温箱内，37℃，培养48h后进行检测。 　　2.3雷公藤对体外培养小鼠T淋巴细胞亚群影响的检测吸取细胞， 离心，弃上清液， PBS重悬细胞入流式试管中，离心，弃上清，洗涤细胞，吸弃上清；每管分别加入5μL FITC anti-mouse CD3、5μL PE anti-mouse CD4和5μL FITC anti-mouse CD3、10μL PE anti-mouse CD8；震荡，室温避光保存30min；加入500μL 4%多聚甲醛，应用流式细胞仪检测，经488nm激光激发，依CellQuest软件，每个样本取10000个细胞。 　　2.4统计学方法实验数据经SPSS11.0软件处理，多组间两两比较采取单因素方差分析。 　　3结果 　　见表1,表2,表3。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　雷公藤多苷可以抑制Th细胞的表达。雷公藤多苷各浓度组体均可以显著降低体外培养的ACD小鼠Th淋巴细胞含量（P＜0.01），高浓度组与低浓度比较差异具有显著性（P＜0.01），高浓度组与中浓度组、中浓度组与低浓度组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。 　　雷公藤多苷可以降低ACD小鼠体外培养的Tc淋巴细胞数量，抑制Tc细胞的表达。雷公藤多苷高浓度情况下抑制Tc细胞表达与对照组比较