蛋白质与蛋白质DNA相互作用研究方法加实例 医学演示课件.pptVIP

将荧光蛋白分割成两个不具有荧光活性的分子片段 分别与目标蛋白连接. 如果两个目标蛋白因为有相互作用而靠近，就使得荧光蛋白的两个分子片段在空间上相互靠近，重新形成活性的荧光基团而发出荧光 * . Identification of the SIRTUIN1 (SIRT1)-binding domain of BMAL1.? Binding of SIRT1 to BMAL1 deletion mutants was analyzed by bimolecular fluorescence complementation (BiFC). COS7 cells were transfected with plasmids encoding SIRT1-N-terminal of Venus (VN) and BMAL1-C-terminal of Venus (VC) wildtype (WT) or its various mutants (Δnuclear localization sequence [NLS], BMAL1 without a functional nuclear localization signal; Δbasic-helix-loop-helix [bHLH], encoding BMAL1 Δ71 to 140; ΔPer-Arnt-Sim [PAS]-A, BMAL1 Δ210 to 320; ΔPAS-B, BMAL1 Δ350 to 480; Δtranscriptional activation domain [TAD], BMAL1 Δ553 to 625). The images were captured by fluorescence imaging microscopy using specific filter sets for yellow fluorescent protein and red fluorescent protein. * . 六、蛋白质芯片技术 蛋白质芯片可以用来大规模筛选蛋白之间的相互作用。将荧光标记的探针蛋白与蛋白质芯片孵育，洗脱非特异性结合的蛋白后，可以通过扫描芯片上的荧光点检测到稳定的相互作用蛋白点 。 * . Gong W. et al. (2008) Molecular Plant 1: 27-41. * . 其它蛋白互作技术 　串联亲和纯化（TAP） 表面等离子共振（SPR） 噬菌体展示技术(phage display approach) 融合蛋白亲和色谱法(protein fusion affinity chromatography) 原子作用力显微技术(atomic force microscopy, AFM ) * . 蛋白质与DNA相互作用 （一）酵母单杂交系统（Yeast one-hybrid system） 该技术是上世纪90年代中发展起来的研究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，在酵母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 * . 蛋白质与蛋白质的相互作用研究方法 蛋白质与DNA相互作用研究方法 * . 蛋白质与蛋白质的相互作用的研究方法 酵母双杂交系统Yeast Two-Hybrid Systerm 免疫共沉淀Co-immunoprecipitation (Co-IP) GST pull-down 技术 荧光共振能量转移Fluorescent Resonant Energy Transfer （FRET） 双分子荧光互补（Bimolecular Fluorescent Complement）BIFC 蛋白质芯片技术 其它方法 * . 酵母双杂交系统 * . 1.1 酵母双杂交技术的原理 酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。他的产生是基于对酵母转录因子GAL4性质的研究. 基因转录不仅需要有特定的DNA顺式序列结构，而且也需要有反式转录激活因子的参与。 转录激活因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNA binding domain, DB)和转录激活结构域(activation domain, AD), 它们都是转录激活因子发挥功能所必需的。 单独的BD或AD都不能激活基因转录，但不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。