常见的免疫共沉淀(Immunoprecipitation,+IP).ppt

乙醇沉淀dna和异丙醇沉淀dna的区别? ? 异丙醇和酒精都是有机溶剂，一般来讲，提取质粒的时候一开始都要用异丙醇沉淀，因为异丙醇沉淀的效果要好一些，但最后大多用酒精沉淀，因为酒精容易挥发，对下游的实验影响小?。 ???? 异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，用乙醇的目的是去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。?有时还用70%的乙醇洗样品也是为了增加盐的溶解度。??在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2倍体积乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。? ???? 异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。 异丙醇： 优点：所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大DNA样品的沉淀。0.54~1.0倍体积的异丙醇可选择性沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA；但对5sRNA、tRNA和多糖产物不产生沉淀，一般不需要在低温条件下长时间放置。? ???? 缺点：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去，所以常规需要用70％的乙醇漂洗DNA沉淀数次。?? 乙醇：沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95％乙醇可有效沉淀DNA，对于RNA则需要将乙醇量增加至2.5倍. * 免疫共沉淀 (CO—immunoprecipitation) ? ? 用抗体将相应特定分子沉淀的同时，与该 分子特异性结合的其他分子也会被带着一 起沉淀出来的技术。这种技术常用于验证 蛋白质之间相互特异性结合。 免疫共沉淀可分为细胞内过表达蛋白、细 胞内源性蛋白、组织内蛋白的免疫共沉淀。 基本原理 ? 细胞裂解物中加入抗体，这样可与已知抗 原形成特异的免疫复合物，若存在与已知 抗原相互作用的蛋白质，则免疫复合物中 还应包含这种蛋白质；经过洗脱，收集免 疫复合物，然后分离该蛋白质，对该蛋白 质进行N端氨基酸序列分析，推断出相应的 核苷酸序列。将包含活性物质的组织或细 胞构建成cDNA文库，以上述核苷酸序列为 探针从cDNA文库中分离出cDNA克隆 。 实验流程 ? ? ? ? ? ? （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适 量细胞裂解缓冲液（含蛋白 免疫共沉淀酶 抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于 4°C， 最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析， 剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解 液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量 裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖 珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中 4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼 脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底； 将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液 洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲 液，沸水煮5分钟； （6）SDS, Western blotting或质谱 仪分析。 ? 一、 样品处理： 二、 抗体-agarose beads孵育 三、 抗体-agarose beads复合物洗涤： 四、 鉴定 免疫共沉淀技术的应用 肿 瘤 酶与病毒 信号传导 寄生虫 免疫共沉淀技术的优点与局限性 ? 优点： 与蛋白质亲和层析一样，检测的产物 是蛋 白质的粗提物； 抗原与相互作用的蛋白以细胞中相类似的 浓度存在，避免了过量表达所造成的人为效 应； 蛋白质以翻译后被修饰的天然状态存在； 复合物以天然状态存在，蛋白的相互作用 可以在天然状态下进行，可以避免人为影响， 可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复 合体. ? 局限性: 需要多克隆抗体或mAb，因而对大规模筛 选未知蛋白会遇到障碍。 免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合 物为直接相互作用的两种蛋白。 用于免疫共沉淀的抗体不总是与操作相合 适，与Western blotting或者ELISA相比容易出 现假阳性反应。 灵敏度不如亲和色谱高。 不适于检测构成巨大、不溶性的大分子结 构的蛋白质一蛋白质相互