荧光探针在细胞生物学中运用.ppt

* 激光扫描共聚焦显微镜技术 基本功能 （一）多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集 光学显微镜分辨率: 0.25μm 共焦显微镜分辨率: 0.18μm （二） 具有连续光学切片功能和Z向观察能力 样品厚度可达500μm, 深度分辨率为0.1μm； 扫描模式：xy：观察样品不同层面的荧光强度变化 xz：观察样品沿Z轴的荧光强度变化 A Series of Image of xy-section Cultured gliocyte of rat brain stained by Fluorescin. （三）活组织和活细胞的动态变化 （四）细胞内各种离子的动态测量和分析 利用激光扫描技术，借以特定的荧光探针，快速、 准确地测定细胞内各种离子含量，包括Ca++、Mg++、 Na+、K+、H+以及pH值等。 细胞内游离钙测定 细胞内Ca2+稳态的维持对生命活动是至关重要的， 病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱， 致细胞坏死和凋亡，测定细胞内钙在生理、病理和 药理学上均具有重要意义。 CLSM 提供高分辨率二维图像和三维图像 准确测定单个细胞内不同部位的Ca++ 含量 实时动态观察Ca++ 含量变化 钙敏荧光探针 激发波长 发射波长 Quin-2 339 nm 492 nm Indo-1 350 nm 485 nm Fura-2 380 nm 510 nm Fluo-3 490 nm 525 nm Calcium Green 505 nm 530 nm Calcium Orange 505 nm 530 nm 细胞内Ca2+动态测量和分析 Ca2+-imaging: UV-uncaging Ca-Indicator: Fluo 4, 488 nm Pancreatic acinar cells 细胞内Ca2+动态测量和分析 细胞内Ca2+动态测量和分析 Cultured hippocampal neurons of rat Fluo-3(AM) （五）多通道扫描同时获得几种颜色的重叠图像 共定位（Co-localization）：是指两个或多 个分子（蛋白）完全处于同一空间位置上。 多通道同步采集图像 研究各种组织和细胞内物质之间的相互关系 Mouse cerebellar cortex. Hoechst 33258, anti-GFAP/Cy5, anti-calbindin-D28k/Cy3 （六）三维重建和三维显示 LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三 维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的 三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系， 用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。 三维显示 焦点扩展深度法 A Series of Image of xy-section Three Dimensional Image Obj: 100/1.2NA W Step: 0.50 34-section （七）实验中需要注意的几个问题 1. 荧光探针的选择： 确定用什么染料染色, 检查其光谱性质, 激发波长, 发射波长,确信手头有相匹配的CONFOCAL的激光器. 2. Multi-labelling：合适的激光波长、不重叠的发射光谱 3. 扫描参数：Laser、PMT、z-step、Section 免疫荧光细胞化学技术 流式细胞仪 样品 培养细胞 新鲜组织 石蜡包埋 单细胞 悬液 标记 荧光抗体 检测 表型测定 细胞分选 流式细胞术操作流程 统计学 分析 继续 培养 流式细胞仪检测