单克隆抗体的制备[001].docVIP

单克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备 1975年Kohler和Milstein首先报道用细胞杂交技术使经绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，建立起第一个Ｂ细胞杂交瘤细胞株，并成功地制得抗SRBC的单克隆抗体（monoclonalantibody,McAb）。迄今全世界已研制成数以千的McAb。 单克隆抗体的理化性状高度均一，生物活性单一，与抗原结合的特异性强，便于人为处理和质量控制，并且来源容易，所以一问世便受到欢迎和重视。在医学领域中，McAb在诊断疾病、判断预后、防治疾病以及疾病机制研究等方面起着巨大的促进作用。为此，两位发明者于1984年获诺贝??窖Ы薄? 第一节 杂交瘤技术的基本原理 杂交瘤抗体技术的基本原理是通过融合两种细胞而同时保持两者的主要特征。这两种细胞分别是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。脾淋巴细胞的主要特征是它的抗体分泌功能和能够在选择培养基中生长（选择原理见后），小鼠骨髓瘤细胞则可在培养条件下无限分裂、增殖，即??健坝郎?毙浴Ｔ谘≡衽嘌??淖饔孟拢?挥校孪赴?牍撬枇鱿赴?诤系脑咏幌赴?啪哂谐中?鲋车哪芰Γ?纬赏?本弑缚固宸置诠δ芎捅３窒赴?郎?粤街痔卣鞯南赴?寺 Ｆ湓?泶酉铝屑父鲋饕?街璨?鳌? （一）细胞的选择与融合 建立杂交瘤技术的目的是制备对抗原特异的单克隆抗体，所以融合细胞一方必须选择经过抗原免疫的Ｂ细胞，通常来源于免疫动物的脾细胞。脾是Ｂ细胞聚集的重要场所，无论以何种免疫方式刺激，脾内皆会出现明显的抗体应答反应。融合细胞的另一方则是为了保持细胞融合后细胞的不?显鲋常?挥兄琢鱿赴?啪弑刚庵痔匦浴Ｑ≡裢?惶逑档南赴?稍黾尤诤系某晒β省６喾⑿怨撬枇鍪牵孪赴?刀裥灾琢觯??允抢硐氲钠⑾赴?诤习槁隆Ｄ壳俺Ｓ玫模孪赴?鲋暧校?P3-X63-Ag8（Kohlerand Milstein,1975）,P3-NSI/1-Ag4-1（Kohler and Milstein,1976），X63-Ag8.653（Kearney et al,1979），Sp2/0-Ag14（Schulman et al,1978）等，这些细胞株皆为HAT敏感细胞株。 使用细胞融合剂造成细胞膜一定程度的损伤，使细胞易于相互粘连而融合在一起。最佳的融合效果应是最低程度的细胞损伤而又产生最高频率的融合。聚乙二醇（PEG 1000～2000）是目前最常用的细胞融合剂，一般应用浓度为40％（W/V）。 （二）选择培养基的应用 细胞融合是一个随机的物理过程。在小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞混合细胞悬液中，经融合后细胞将以多种形式出现，如融合的脾细胞和瘤细胞、融合的脾细胞和脾细胞、融合的瘤细胞和瘤细胞、未融合的脾细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体形式等。正常的脾细胞在培养基中存活??5～7天，无需特别筛选 ，细胞的多聚体形式也容易死去。而未融合的瘤细胞则需进行特别的筛选去除。 细胞的DNA合成一般有两条途径。主途径是由糖和氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，叶酸作为重要的辅酶参与这一合成过程。另一辅助途径是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下，经次黄嘌呤磷酸核糖转化酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化作用合成DNA。细胞融合的选择?嘌??杏腥?种关键成份： 次黄嘌呤（hypoxanthine,H）、氨甲喋呤（aminopterin,A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine,T），所以取三者的字头称为HAT培养基。氨甲喋呤是叶酸的拮抗剂，可阻断瘤细胞利用正常途径合成DNA，而融合所用的瘤细胞是经毒性培养基选出的HGPRT- 细胞株，所以不能在该培养基中生长。只有融合细胞具有亲代双方的遗传性能，可在HAT培养基中长期存活与繁殖（图11-1）。\par 图11-1 细胞融合与HAT选择示意图 （三）有限稀释与抗原特异性选择 在动物免疫中，应选用高纯度抗原。一种抗原往往有多个决定簇，一个动物体在受到抗原刺激后产生的体液免疫应答，实质是众多Ｂ细胞群的抗体分泌。而针对目标抗原表位的Ｂ细胞只占极少部分。由于细胞融合是一个随机的过程，在已经融合的细胞中，有相当比例的无关细胞的融合体??杈?秆∪コ?。筛选过程一般分两步进行：一是融合细胞的抗体筛选，二是在此基础上进行的特异性抗体筛选。将融合的细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的细胞数在0至数个细胞之间（30%的孔为0才能保证每个孔中是单个细胞），培养后取上清以ELISA法选出抗体高分泌性细??徽庖还?程常被习惯地称作克隆化。将这些阳性细胞再行克隆化，应用特异性抗原包被的ELISA找出针对目标抗原的抗体阳性细胞株，增殖后进行冻存、体外培养或动物腹腔接种培养。 第二节 制备单克隆抗体的基本技术 制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程如图11-2。 ┌──